Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması
Summary
molekül bağlarının doğasında titreşim dayalı Tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) mikroskopi etiket ücretsiz kimyasal seçici canlı hücre görüntüleme izin verir. safir lazer ve bir OPO lazer: Bu çalışma femtosaniye Ti dayalı standart bir multiphoton lazer tarama mikroskobu tamamlayıcı mikroskopi tekniği uygulanmasını sunar.
Abstract
Bir femtosaniye Ti birleştirerek lazer tarama mikroskobu: Lazer çizgisini çoğaltmak için safir lazer ve optik parametrik osilatör (OPO) biyologlar için kullanılabilir hale gelmiştir. Bu sistemler, öncelikle çok kanallı iki foton floresan mikroskobu için tasarlanmıştır. Ancak, herhangi bir değişiklik olmadan, bu tür ikinci harmonik nesil (SHG) veya üçüncü harmonik nesil (THG) gibi tamamlayıcı doğrusal olmayan optik mikroskop da yapılandırılmış moleküller veya sulu Gelir Orta etiketi içermeyen görüntüleme sağlayan bu set-up ile yapılabilir lipit arayüzleri. Bu teknikler, in vivo gözlem için uygundur, ancak kimyasal özgüllük sınırlıdır. Kimyasal seçici görüntüleme Raman saçılması dayalı doğal titreşim sinyalleri elde edilebilir. Konfokal Raman mikroskobu 3D uzaysal çözünürlüğü sağlar, ancak yüksek ortalama güç ve uzun edinimi süresi gerektirir. Bu zorlukları aşmak için, lazer teknolojisindeki son gelişmeler devel izin vardoğrusal olmayan optik titreşim mikroskopi opment, özellikle tutarlı bir anti-Stokes Raman içinde (CARS) saçılma. ARABALAR mikroskopi Bu nedenle kimyasal eşleştirme (OH streç titreşimler yoluyla) (CH streç titreşim yoluyla) lipidler, su, proteinler veya DNA, biyolojik ve canlı hücre görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, standart bir OPO-birleştiğinde multiphoton lazer tarama mikroskobu CARS tekniğin uygulanmasını açıklar. Bu lazer ışını yolu birinin uzunluğunun ayarlanması ile iki lazer hatları arasında zamanlı senkronizasyon dayanır. Biz varolan multiphoton sistemi üzerinde bu tekniğin bir adım-adım uygulama mevcut. Deneysel optik bir temel arka plan yararlı ve sunulan sistem pahalı ek donanım gerektirmez. Ayrıca kemirgen siyatik sinirinin miyelin kılıflarının elde görüntüleme CARS göstermektedir, ve bu görüntü, standart t gibi doğrusal olmayan optik görüntüleme ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir göstermektedirwo-foton floresan tekniği ve ikinci harmonik nesil.
Introduction
Optik mikroskop bir hücre içi çözünürlük ile biyolojik sistemlerin canlı dinamik süreçlerin tahribatsız görselleştirme için önemli bir teknik haline gelmiştir. Floresan mikroskobu nedeniyle yüksek özgüllük ve duyarlılık 1 şu anda canlı hücrelerde kullanılan en popüler görüntüleme kontrast. flüoresan büyük bir palet (eksojen boyalar, genetik olarak kodlanmış proteinleri, yarıiletken nanopartiküller) ortaya çıkmıştır. Çeşitli örnek aydınlatma floresan tabanlı teknikler 3D görüntüleme gerçekleştirmek için ve 2 photobleaching bu tekniğin ana dezavantajı azaltmak için (örneğin konfokal veya iki foton mikroskopi gibi) gelişmiştir. Moleküler türlerin çoğu özünde floresan değildir ve bu nedenle bu fluorophores yapay görüntülü numunede tanıtılacak zorunda çünkü başka sınırlamalar fluorofor etiketleme şartını içermektedir. Bu yapay manipülasyon küçük moleküller özellikle yıkıcı olabilir ya da pot uyarır olabilirential foto-toksisite. Bu sebepler in vivo gözlemler için floresan mikroskopi değil uygundur olun. Bu nedenle, flüoresan moleküller kullanılmadan yüksek hassasiyet ve özel moleküler kontrastlı optik görüntüleme tekniklerinin kullanımı biyomedikal son derece arzu edilir.
Etiketleme veya lekelenme olmadan birkaç doğrusal olmayan optik görüntüleme teknikleri ikinci harmonik nesil (SHG) 3,4 ve üçüncü harmonik nesil (THG) 5 de dahil olmak üzere, ortaya çıkmıştır. SHG mikroskobu gibi mikrotübüllerin veya kollajen 6 olarak supramoleküler düzeyde görüntü yapısal düzenlemelerle için kullanılır olmuştur. THG gibi bir sulu ortam ve lipid 7 arasındaki ara optik çoktürellik oluşturulur. THG aynı zamanda görüntü miyelin 8,9 gösterildi. Her iki teknik, bir iki-fotonlu floresan mikroskop üzerinde uygulanan ve tek bir lazer ışını gerektiren edilebilir. yüksek güç lazer yoğunluğu gerektiren Ancak (tipik olarak 50yaşam örneklerinde zararlı olduğunu ve net bir şekilde görüntü özgü biyolojik yapıları için gerekli olan kimyasal özgüllük vermeyin THG 9 için 1180 nm), 50 mW – SHG 10, 25 860 nm'de mW.
Kimyasal olarak, seçici görüntüleme Raman saçılımı göre temel molekül titreşim sinyallerinden elde edilebilir. bir ışık demeti meselesi çarptığında, fotonlar emilir ve atomlar veya moleküller tarafından dağınık olabilir. Dağınık fotonların çoğu gelen fotonların aynı enerjiyi, yani frekansı olacaktır. Bu süreç Rayleigh saçılması denir. Bununla birlikte, bir foton az sayıda Raman saçılımı adlandırılan bir inelastik partikül saçma işlemi ile örneğin, gelen fotonların, bir frekansından farklı bir optik frekansta saçılan edilecektir. enerji farkı moleküler yapı ve çevreye bağlı olarak titreşim modlarının uyarma kaynaklanır. Bu nedenle, ani Raman saçılımı ataides kimyasal seçici görüntüleme gibi farklı moleküller belirli titreşim frekansları vardır. Ancak nedeniyle, son derece zayıf bir sinyalin sınırlıdır. Konfokal Raman mikroskobu geliştirdi ve 3D uzaysal çözünürlüğü sağlar, ancak yüksek ortalama güç ve uzun edinimi süresi 11 gerektirir olmuştur. Bu zorlukları aşmak için, lazer teknolojisindeki son gelişmeler, özellikle tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması nonlineer optik titreşim mikroskopi yükselişi, (CARS) 11,12,13 sağladı.
ARABALAR üçüncü mertebeden doğrusal olmayan optik bir süreçtir. Frekans ω P bir pompa ışınının oluşan üç lazer ışınları, frekans ω S bir Stokes ışın ve bir prob ışın (genellikle pompa olmak üzere) bir numunede odaklı ve (frekans ω AS = bir anti-Stokes ışını oluşturmak 2ω P – ω G) 14. Anti-Stokes sinyali önemli ölçüde geliştirilmiş olabilir zaman frekans farkı(- ω S ω P) pompa ve Stokes Raman moleküler titreşim Ω R = için ayarlanmıştır kirişler arasındaki. ARABALAR sinyal birden foton etkileşimi dayanmaktadır. Bu nedenle spontan Raman saçılması daha güçlü büyüklükte bir tutarlı sinyal emir üretir.
ARAÇLAR mikroskopi ilk deneysel Duncan ve ark., 15 ile gösterilmiştir. Zumbusch ve diğ., Yüksek sayısal açıklık bir objektif lens iki odaklı yakın kızılötesi femtosaniye lazer ışınları kullanılarak ARAÇLAR faz eşleme koşulunu sağlayan ve iki foton olmayan rezonans arka plan 16 kaçınarak, daha sonra teknik geliştirilmiştir. ARABALAR mikroskopi Bu nedenle kimyasal canlı hücrelerde 19,20 yılında (CH streç titreşim yoluyla) gibi lipidler gibi molekülleri 17,18, su (OH streç titreşimler yoluyla), proteinler, DNA tespit ederek, canlı hücre ve dokular görüntüleme için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır aynı zamanda kimyasal bileşiğin dötereilaç 21 ve kozmetik uygulamalar 22 s.
doğrusal olmayan mikroskopi önemli bir sınırlama karmaşıklığı ve optik kaynakların maliyeti kaynaklanır. Bir OTOMOBİLLER sistemin kısa darbe süreleri ile ve zamansal ve mekansal senkronize darbe trenler ile iki dalga boyu ayarlanabilir lazer gerektirir. Erken OTOMOBİLLER mikroskoplar iki senkronize pikosaniye Ti dayanmaktadır: safir lazerler 20. Bir supercontinuum ışık kaynağı 23 üreten safir lazer: CARS görüntüleme ayrıca tek bir femtosaniye Ti elde edilmiştir. Son zamanlarda, tek femto saniye Ti oluşan lazer kaynakları: ayarlanabilir bir optik parametrik osilatör (OPO) pompalama safir lazeri arabalar mikroskopi için kullanılmıştır. Bu set-up özünde geçici pompa ve tam moleküler titreşim spektrum 24 kapsayan Stokes kiriş arasındaki bir frekans farkı ile kirişler senkronize sağlar. Buna ek olarak, lazer tarama mikroskobu Ayrıntılı bir yol tarifi göreöncelikle iki foton floresan (TPF) için kullanılan anahtar fs lazer ve OPO olmayan fizikçiler için şimdi mevcuttur. Her doğrusal olmayan (NLO) görüntüleme yöntemi özel yapılar veya moleküller duyarlı olduğu gibi set-up potansiyeli büyük ölçüde diğer doğrusal olmayan optik görüntüleme katılmasıyla ek yatırımı gerektirmeden gelişmiş olabilir. Multimodal NLO görüntüleme nedenle karmaşık biyolojik örneklerinde 25 NLO mikroskopi potansiyelini büyük harfe çevirir. Bu tekniklerin birleştirme lipid metabolizması, deri ya da kanser gelişimi 26, iskelet kas gelişimi 27 aterosklerotik lezyonlar 28, özellikle de bir çok biyolojik soru incelemeye olanak sağlamaktadır. Ayrıca, ARABALAR ile lazer ışını tarama uygulaması yüksek oranlı görüntüleme, yani in vivo dinamik süreçleri incelemek için cazip bir aracın yeteneği kazandırır.
Bu çalışmanın amacı, t uygulamak için her adımı göstermektirStandart multiphoton lazer tarama mikroskobu o CARS tekniği. Mikroskop FSEC Ti dayanmaktadır: safir lazer ve bir OPO: biyologlar için bir yazılım tarafından işletilen (Ti tarafından pompalanan lazer safir). entegrasyon zaman iki ışın senkronize etmek için lazer ışını yolu birinin uzunluğunun ayarlanmasıyla gerçekleştirilmiştir. Biz deneysel optik sadece temel bir arka plan gerektiren bu tekniğin adım adım uygulanması açıklanmaktadır. Biz de CARS kemirgenler siyatik sinirin miyelin kılıflarının elde görüntüleme göstermek ve bu görüntüleme gibi standart iki-foton floresan tekniği ve ikinci harmonik nesil olarak, diğer doğrusal olmayan optik görüntüleme ile eş zamanlı olarak yapılabilir göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
işin en zorlu kısmı lazer ışınları zamansal eşitleme olduğunu. Bu hızlı bir osiloskop ile birlikte hızlı bir fotodiyot gerektirir, ancak zaman içinde sadece kaba bir örtüşen ilk başta yapılabilir. Sonra birkaç cm daha ayarlaması gerekmemektedir. Son olarak, bir lineer çeviri aşamasında tarafından mikrometre hareket OTOMOBİLLER sinyali tetiklemek için gecikme hattı uzunluğunun nihai ince ayar yapmak mümkündür. yapıldı aşaması mikrometre sürücü ayarlanması sureti ile gözlemlenen Bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
