قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري
Summary
The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.
Abstract
The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots (“H” and “F”) of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.
Introduction
ومحببة والوحيدات البلعمة / التأكسدي انفجار (OB) النشاط الاختبار هو بسيط، وتقنية مستقيم إلى الأمام التي كثيرا ما تستخدم لجمع المعلومات عن وظيفة المناعة الفطرية التالية ممارسة طويلة ومكثفة. 1-4 عند دراسة استجابة الجهاز المناعي ل حافز، المحببة وحيدات ذات أهمية خاصة لأنها تلعب دورا محوريا في الدفاع المضيف وهي الخلايا المناعية الأولى لتتراكم في موقع الإصابة. 5 العدلات، وهو نوع من محببة، هي الخلايا الأولى للنقل من داخل العضلات التالفة الأنسجة التالية ممارسة مكثفة. 6 البلعمة والنشاط OB هي التدابير الأكثر شيوعا من المحببات والوحيدات وظيفة و 7 و يفضل كمؤشرات للالفطرية وظيفة الخلايا المناعية بسبب دورها المركزي في كل من عملية العدوى وعملية الإصلاح.
الفحص الموضحة في هذه utili مخطوطةZES تدفق الأساسي الكريات لتوفير تحديد كمية محببة والبلعمة الوحيدات والنشاط OB في الدم الكامل. استخدام الدم الكامل في هذه التقنية هو مفيد لأنه يسمح للفحص لإجراء دون إجراء تنقية تستغرق وقتا طويلا. هذا الاختبار يمكن بسهولة أن يتم تعديل لاستيعاب مجموعة متنوعة من التصاميم البحوث وقدرات المختبر. على سبيل المثال، لياو وآخرون تستخدم تقنية مماثلة لاظهار ان النشاط العدلات OB وزيادة ونقص العدلات البلعمة التالية إصابات في الدماغ. 8 وفي مثال آخر، وصفت McFarlin وآخرون. تعديلا أنيقة من هذه التقنية التي تستخدم allophycocyanin (APC ) -conjugated CD66b وجنبا إلى جنب عالية الأداء APC مترافق CD45 وضع العلامات مع الصورة القائمة على التدفق الخلوي لتصنيف المحببة من حيث الأنشطة البلعمة وOB بهم. 7،9
وقد استخدم فريق البحث لدينا التعديلات المختلفة لهذه الشركة المصرية للاتصالاتchnique كمؤشر على وظيفة المناعة الفطرية في السكان يعانون من زيادة الوزن، السمنة، ورياضية لنحو 20 عاما. 10،11 النص أدناه سوف توفر للقارئ مع إرشادات خطوة بخطوة لأداء هذا الاختبار وتسليط الضوء على المجالات التي يمكن للقارئ أن تتكيف لتلبية احتياجات أبحاثهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد مؤشرين للمحببة وظيفة الوحيدات. لقد حددنا بعض الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح هذا الاختبار. واحدة من هذه الخطوة هي حضانة الجليد حمام الذي يحدث مباشرة قبل إضافة البكتيريا. سوف تبريد شامل لجميع عينات تقليل تأثير درجة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف زاك شو كيسي جون، ولين Cialdella كام على المساعدة التي قدموها خلال الاستفادة المثلى من هذا الإجراء.
Materials
| 12 x 75 mm tubes, with cap | VWR | 20170-579 | You will need 2 tubes per sample ("H" and "F") plus 3 tubes per batch (for assay controls; "F", "H", and "Blood only"). |
| PBS (10X), pH 7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
| Bottle top 0.2 µm cellulose acetate filter (500 ml capacity) | Fisher Scientific | 09-741-07 | |
| Glucose, powder | Life Technologies | 15023-021 | |
| Citric acid (anhydrous, cell culture tested, plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C2404-100G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641-25G | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) (HE) | Life Technologies | D11347 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) Anhydrous | Life Technologies | D12345 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, fluorescein conjugate (FITC) | Life Technologies | S2851 | |
| Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParticles, unlabeled | Life Technologies | S-2859 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| 4.0 mL vacutainer containing 7.2 mg K2EDTA, spray-dried | VWR | BD367861 | You will need 1 K2 EDTA blood collection tube per sample. |
| 4.0 mL vacutainer containing 68 USP units Lithium Heparin, spray-coated | VWR | BD367884 | You will need 1 Lithium Heparin blood collection tube per sample. |
| COULTER Ac·T 5diff CP | Beckman Coulter | 6605705 | i.e., hematology analyzer |
| COULTER Ac·T 5diff Rinse | Beckman Coulter | 8547167 | |
| COULTER Ac·T 5diff Fix | Beckman Coulter | 8547171 | |
| COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse | Beckman Coulter | 8547170 | |
| COULTER Ac·T 5diff Hgb Lyse | Beckman Coulter | 8547168 | |
| COULTER Ac·T 5diff Cal Calibrator | Beckman Coulter | 7547175 | |
| COULTER Ac·T 5diff Control Plus | Beckman Coulter | 7547198 | |
| AcT 5diff Diluent | Beckman Coulter | 8547169 | |
| 200 µL extended-length pipette tips | VWR | 37001-526 | |
| Insulated ice pan | VWR | 89198-980 | For ice water bath. |
| Open metal tube rack | VWR | 60916-702 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 26140-111 | |
| TQ-Prep Workstation | Beckman Coulter | 6605429 | i.e., automated cell lyse preparation workstation |
| ImmunoPrep Reagent System | Beckman Coulter | 7546999 | i.e., RBC lyse/WBC fix reagent system |
| Cytomics FC500 MCL Flow Cytometry System with CXP Software | Beckman Coulter | 626553 | |
| IsoFlow Sheath Fluid | Beckman Coulter | 8547008 | |
| COULTER CLENZ | Beckman Coulter | 8546929 | |
| Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | 6605359 | i.e., alignment and fluidics verification fluorospheres |
| FlowJo Software | FlowJo | FlowJo | i.e., flow cytometry analysis software |
| Excel Software | Microsoft | Microsoft Excel | i.e., electronic spreadsheet program |
References
- Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725 (2014).
- Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
- Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
- Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
- Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
- Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
- McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
- Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963 (2013).
- McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
- Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
- Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
- Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
- Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621 (2012).
