Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo
Summary
Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.
Abstract
Massimizzare il vantaggio di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per la ricerca, la modellazione della malattia, farmaceutica e applicazioni cliniche richiede metodi affidabili per la produzione su larga scala di tipi di cellule funzionali, tra cui cardiomiociti. Qui mostriamo che la manipolazione temporale del WNT, TGF-β, e SHH vie di segnalazione porta a linee HPSC altamente efficiente cardiomiociti differenziazione di cella singola diversi passaggi sia in sospensione statica e sistemi di sospensione bioreattori agitati. Utilizzando questa strategia ha comportato ~ 100% battendo sferoidi, contenente costantemente> 80% delle cellule T-positivi di troponina cardiaca dopo 15 giorni di coltura, convalidati in più righe HPSC. Riportiamo anche una variazione di questo protocollo per l'uso con linee cellulari attualmente non adeguate alle passaging cella singola, il cui successo è stata verificata in 42 linee HPSC. Cardiomiociti generati utilizzando questi protocolli esprimono marcatori specifici per lignaggio e spettacolo previsto electrophysfunzionalità iological. Il nostro protocollo presenta una piattaforma semplice, efficiente e robusto per la produzione su larga scala di cardiomiociti umani.
Introduction
Le cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs), comprese le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), hanno la capacità di auto-rinnovamento e la capacità di differenziarsi in cellule dei tre strati germinali embrionali 1,2. Grazie a queste caratteristiche, hPSCs forniscono una fonte preziosa e illimitato per la generazione e scalabile produzione di tipi di cellule malattie rilevanti per la modellazione di malattie umane 3-5, per high-throughput screening di stupefacenti e di tossicità saggi 6,7 e potenzialmente per le applicazioni cliniche 8 . Generazione di cardiomiociti dal hPSCs offre l'opportunità di indagare specificamente i meccanismi di malattie cardiovascolari umane complesse ei loro possibili trattamenti, precedentemente oltre la portata delle nostre capacità a causa della mancanza di modelli animali e / o la disponibilità di tessuti primari colpiti.
Tutte le applicazioni di cui sopra di hPSCs necessitate la produzione di un massiccio numero di cardiomiociti altamente arricchito e funzionali. Pertanto, la disponibilità di un efficiente, riproducibile e scalabile in vitro cardiaca protocollo differenziazione adatto a più linee HPSC è cruciale. Protocolli di differenziazione dei cardiomiociti convenzionali hanno impiegato strategie diverse quali la formazione del corpo embrioide 9, tecniche di co-coltura di 10, induzione con cocktail di citochine 11 e metodi di proteina di trasduzione 12. Nonostante i progressi in queste tecniche, la maggior parte ancora soffrono di scarsa efficienza, richiedono costosi fattori di crescita, o offrire universalità limitata quando si tenta di utilizzare più linee HPSC. Fino ad oggi, queste sfide hanno fissato limiti alla produzione di cardiomiociti HPSC derivati per gli studi di terapia cellulare in modelli animali, così come nel settore farmaceutico per la scoperta di nuovi farmaci 13. Pertanto, lo sviluppo di tecniche robuste e convenienti per grandila produzione di -scale funzionali cardiomiociti HPSC-derivati in sistemi di coltura scalabili sarebbe in gran parte facilitare le loro applicazioni commerciali e cliniche.
In questo manoscritto, riportiamo lo sviluppo di un sistema di differenziazione cardiaca conveniente e integrata con elevata efficacia, riproducibilità e applicabilità alle hESC e hiPSCs generati da una varietà di fonti e metodi di coltura, compreso un metodo per la produzione su larga scala altamente popolazioni arricchite di cardiomiociti HPSC-derivati dall'uso di un bioreattore. Inoltre, abbiamo ottimizzato questo protocollo per le linee HPSC non adattati alla rinfusa, coltura cellulare libero e / o singola, come hiPSCs di nuova costituzione o grandi coorti di linee HPSC rilevanti per l'analisi dei meccanismi di malattia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cardiomiociti derivati da hPSCs sono una fonte estremamente attraente per l'uso in modelli di malattia umana, farmaci di screening test / tossicità e, forse, in futuro, le terapie rigenerative. Uno dei principali ostacoli all'utilizzo di queste cellule però, è la capacità di fornire materiale di alta qualità sufficiente per il loro uso efficace. Utilizzando il nostro protocollo descritto, offriamo un metodo che supera questa limitazione.
Recentemente, piccole molecole sint…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by grants provided from Royan Institute, Iranian Council of Stem Cell Research and Technology, the Iran National Science Foundation (INSF), the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC; 354400), the National Heart Foundation of Australia/Heart Kids Australia (G11S5629), and the New South Wales Cardiovascular Research Network. HF was supported by a University International Postgraduate Scholarship from the University of New South Wales, Australia. RPH was supported by a NHMRC Australia Fellowship. The authors express their gratitude to the human subjects who participated in this research.
Materials
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement (KO-SR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| MEM Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Miltenyi Biotec | 130-093-843 | |
| RPMI1640 | Life Technologies | 11875093 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190144 | |
| DPBS | Life Technologies | 14287072 | |
| Attachment Factor (AF) | Life Technologies | S006100 | |
| ECM Gel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fatal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| B27 minus insulin | Gibco | A18956-01 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17140-019 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Mitomycin C | Bioaustralis | BIA-M1183 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotec | 130-104-172 | |
| IWP2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-095-561 | |
| Purmorphamine | Miltenyi Biotec | 130-104-465 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Miltenyi Biotec | 130-104-169 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Poly Vinyl Alcohol (PVA) | Sigma-Aldrich | 363073 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Trypan Blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies Inc. | AM105 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| CELLSPIN | Integra Biosciences | 183 001 | |
| Spinner flask with 1 pendulum, 100 ml | Integra Biosciences | 182 023 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | Prepared in-house (or commercially available) | ||
| Human pluripotent stem cell (hPSC) lines | Prepared in-house (or commercially available) |
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