In Vitro permeazione di ferritine FITC-caricati attraverso un Rat barriera emato-encefalica: un modello per studiare la consegna di Nanoformulated Molecole
Summary
A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.
Abstract
Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.
Introduction
La resistenza del sistema nervoso centrale (SNC) malattie (es. Cancro, epilessia, depressione, schizofrenia e disturbo neurologico HIV-associato) alle terapie farmacologiche è dovuto a diversi meccanismi diversi, tra cui arduo permeazione farmaco attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) . La BBB è il confine che isola i tessuti cerebrali da sostanze circolanti nel sangue. All'interno di questa barriera, uno strato di cellule microvascolari cerebrali endoteliali (BMECs), supportati da periciti e astrociti endfeet, è responsabile per l'alta selettività della BBB a tali farmaci idrosolubili con un peso molecolare superiore a 400 Da 1. Un altro meccanismo di resistenza connessa alla droga è legata alla presenza sul BMECs di trasportatori di efflusso di droga (P-glicoproteina e multidrug resistance proteine), che co-operano per ridurre la penetrazione farmaco nel sistema nervoso centrale e facilitare la loro espulsione dal cervello 2.
Nell'ultima decade, Sono stati sviluppati un gran numero di approcci nanotecnologici per affrontare la sfida clinico e biologico di fornire farmaci attraverso la BBB 3-6. In questo contesto, nanosfere ferritina (FNN) rappresentano una soluzione completamente innovativa e promettente. FNN sono 12 sfere nm di 24 auto-assemblaggio ferritina (Fn) monomeri, che sono disposti in una struttura sferica cava di diametro interno 8 nm. subunità ferritina possono essere smontati a pH acido e riassemblate in un modo a memoria di forma, portando il pH a neutralità, permettendo varie molecole organiche per essere incapsulati. Pertanto, FNN rappresentano un modello interessante per lo sviluppo di multifunzionale drug delivery sistemi 7,8. Inoltre, FNN può interagire con BMECs grazie al riconoscimento specifico di transferrina Receptor (TfR) 1, che è espresso sulla membrana luminale di queste cellule 9.
Finora, diversi modelli in vitro della BBB sono stati sviluppati in order per chiarire trans-BBB permeabilità ai vari farmaci, tossicità verso la BBB, o l'interazione di molecole con trasportatori di efflusso. Infatti, questi modelli sono considerati validi in vitro approcci per un rapido screening di molecole attive prima di procedere con studi in vivo. Questi modelli sono costituiti da un singolo strato endoteliale dei BMECs o BMECs e astrociti co-coltura (più raramente periciti), ottenuto da animali (ratti, topi, maiali e bovini) o linee cellulari umane 10,11,12. Il transendoteliale Resistenza elettrica (TEER) e la permeabilità apparente (P app) di traccianti con un peso molecolare definito rappresentano due parametri critici che vengono utilizzati per determinare la qualità del modello in vitro. Qui si descrive l'impiego di un modello BBB in vitro, sulla base di una co-coltura di ratto BMECs (RBMECs) e nel ratto astrociti corticali (RCA) per studiare la permeazione trans-BBB di nanocages ferritina incapsulare isothi fluoresceinaocyanate (CIC).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo in vitro qui descritto rappresenta un approccio utile convalidato per studiare la consegna trans-BBB di molecole fluorescenti su nanoformulation con le nanoparticelle. Qui usiamo FNN, che rappresenta un buon candidato per studiare la traslocazione di molecole cargo attraverso la BBB. FNN è considerato il Nanovector d'oro per trans-BBB consegna della droga / agenti in quanto è espressamente riconosciuto dal recettore TfR1, che si esprime sulla membrana luminale di BMECs e media l'assorbimento…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia and Sacco Hospital (NanoMeDia Project) for research funding.
Materials
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE |
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