Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için
Summary
A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.
Abstract
Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.
Introduction
Farmakolojik tedavilere merkezi sinir sistemi direnci (merkezi sinir sistemi) hastalıkları (örn., Kanser, epilepsi, depresyon, şizofreni, HIV ile ilişkili nörolojik bir bozukluk) nedeniyle, kan-beyin bariyeri boyunca zorlu ilaç nüfuz dahil olmak üzere çeşitli farklı mekanizmalarla için (BBB) . BBB kanda dolaşan maddelerden beyin dokuları izole eder sınırıdır. Bu bariyer içinde, perisitler ve astrositler endfeet tarafından desteklenen beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BMECs) 'in bir tabakası, bir molekül ağırlığı daha yüksek 400 da 1 olan suda çözülebilen ilaçlara BBB yüksek seçicilik sorumludur. Başka bir ilaç ile ilişkili dirençli mekanizması CNS'ye madde girişini engellemek ve beyin 2 ekstrüzyonu kolaylaştırmak için işbirliği ilaç akış taşıyıcı (P-glikoprotein ve çoklu ilaç direnci proteini), bir BMECs ilgili varlığı ile bağlantılıdır.
Son on yılda, Nanoteknolojik yaklaşımlar çok sayıda BBB 3-6 genelinde uyuşturucu teslim klinik ve biyolojik zorluğu aşmak için geliştirilmiştir. Bu bağlamda, ferritin nanosferler (FNN) tamamen yenilikçi ve gelecek vaat eden bir çözüm oluşturmaktadır. FNN 8 mil iç çapa sahip olan bir içi boş bir küre yapısında düzenlenmiş 24 kendinden montaj ferritin (FN) monomerler, 12 mil kürelerdir. Ferritin alt-birimleri, asidik pH değerinde demonte ve çeşitli organik moleküller kapsüllenecek sağlayan nötr pH getirerek şekil hafızalı bir şekilde kurulabilir. Bu nedenle, FNN çok fonksiyonlu bir ilaç verme sistemleri 7,8 geliştirilmesi için ilginç bir modeli temsil eder. Ayrıca, FNN bu hücrelerin 9 lüminal zarı üzerinde ifade edilen transferin reseptörü (TfR), 1, spesifik tanıma BMECs teşekkür ile etkileşime girebilir.
Şimdiye kadar, BBB in vitro modellerde farklı accueillante geliştirilmiştirr çeşitli ilaçlar, BBB doğru toksisite, ya da akış nakliyeci ile moleküllerin etkileşimi trans-BBB geçirgenliği aydınlatmak için. Gerçekten de, bu modelleri, in vivo çalışmalar ile devam etmeden önce, aktif moleküllerin hızlı taranması için yaklaşımlar, in vitro olarak geçerli kabul edilir. Bu modeller, hayvan (fare, fare, domuz ve dana) veya insan hücre çizgileri 10,11,12 elde BMECs ya da ko-kültür BMECs ve astrositler (nadiren perisitler) tek bir endotel tabaka oluşur. Transendotelyal elektrik direnç (TEER) ve belli bir molekül ağırlığına sahip izleyicilerin belirgin geçirgenlik (Papp) in vitro modelin kalitesini belirlemek için kullanılan iki önemli parametreler temsil etmektedir. Burada sıçan BMECs (RBMECs) bir ko-kültür dayalı bir BBB in vitro modelin istihdam, açıklamak ve sıçan kortikal astrositler (RCAs) floresein isothi encapsulating ferritin nanocages trans-BBB nüfuz incelemek içinocyanate (FITC).
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen in vitro yöntem, nanopartiküller ile nanoformulation girdiğinde flüoresan moleküllerinin trans-BBB teslim incelemek için yararlı bir geçerli bir yaklaşım sunmaktadır. Burada BBB genelinde kargo moleküllerin translokasyon incelemek için iyi bir aday temsil FNN kullanın. Özellikle BMECs lüminal zarı üzerinde ifade edilen ve burada bir reseptör aracılı içselleştirme yolu kullanan nano partıkuler alımını aracılık eder TfR1 reseptör tarafından tanınır çünkü FNN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia and Sacco Hospital (NanoMeDia Project) for research funding.
Materials
| Rat Brain Microvascular Endothelial Cells | Innoprot | P10308 | isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen |
| Cortical Astrocytes | Innoprot | P10202 | isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen. |
| Endothelial Cell Medium kit | Innoprot | P60104 | ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light |
| Trypsin-EDTA without Phenol Red | EuroClone | ECM0920D | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran 40000 | Sigma | FD40S | protect from light |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | diluition in chemical hood |
| Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg | EuroClone | ECB4004L | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| goat serum | EuroClone | ECS0200D | |
| mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor | Dako | M0616 | |
| AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs | ThermoFischer Scientific | A-11003 | protect from light |
| DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFischer Scientific | D1306 | protect from light |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFischer Scientific | P36934 | |
| Poly-L-lysine Hydrobromide | Sigma | P1274 | the same solution can be used several times |
| fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 | the same solution can be used several times |
| Polyethylene terephthalate (PET) inserts | Falcon | F3090 | Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area |
| T75 Primo TC flask | EuroClone | ET7076 | |
| T175 Primo TC flask | EuroClone | ET7181 | |
| EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter | World Precision Instruments Germany | EVOM2 | |
| Endohm- 24SNAP cup | World Precision Instruments Germany | ENDOHM-24SNAP | |
| Light/fluorescence microscope with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module | inverted microscope for live cells with camera |
| Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SPE |
References
- Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3 (2009).
- Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
- Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -. T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140 (2013).
- Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
- Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
- Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
- Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
- Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
- Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
- Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
- Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
- Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278 (2014).
- Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).
