Dette håndskrift beskriver en blød litografi-baseret teknik til at konstruere ensartede arrays af tredimensionale (3D) epitelvæv med defineret geometri omgivet af ekstracellulær matrix. Denne metode kan underkastes en lang række celletyper og eksperimentelle sammenhænge og giver mulighed for high-throughput screening af identiske gentagelser.
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Udviklingen af forgrenede epitelvæv, kendt som forgrening morfogenese, reguleres af celleafledte, fysiske og miljømæssige faktorer. I mælkekirtlen, forgrening morfogenese er en iterativ proces, hvorigennem styret kollektiv cellemigrering skaber en trælignende arkitektur. Det første skridt er primære knop dannelse fra mælkekanalerne, efterfulgt af gren initiering og forlængelse 1,2. Invasion af grene i det omgivende stroma induceres af den systemiske afgivelse af steroidhormoner ved puberteten. Nye primære knopper derefter starter fra enderne af eksisterende filialer, og denne proces fortsætter med at skabe en epitelial træ 3. Selv om der er identificeret mange vigtige biokemiske signaler, en omfattende forståelse af cellens biologiske mekanismer, der styrer denne komplekse udviklingsproces øjeblikket mangler. Desuden mekanistiske undersøgelser af påvirkninger af specifikke signaler er vanskelige at dekonstruere fra erfamenter in vivo, så præcise spatiotemporale forstyrrelser og målinger er ofte ikke muligt.
Tre-dimensionelle (3D) kultur teknikker, såsom hele orgel kultur, primære organoids, og cellekultur modeller, er nyttige værktøjer til systematisk at undersøge mekanismerne bag vævsmorfogenese 4-6. Disse kan være særligt nyttige til bestemmelse af påvirkninger af specifikke faktorer enkeltvis, såsom mekaniske kræfter og biokemiske signaler, på en række celle- adfærd, herunder migration, proliferation og differentiering. 6 Engineered cellekulturmodeller, navnlig let aktivere den forstyrrelse af individuelle celler og deres mikromiljø.
Én sådan kultur model bruger en mikrofabrikation tilgang til ingeniør model brystepitelceller væv med kontrolleret 3D-struktur, der konsekvent og reproducerbart danner grene, der vandrer kollektivt ved induktion med enppropriate vækstfaktorer. Den største fordel ved modellen er evnen til præcist at manipulere og måle effekterne af fysiske og biokemiske faktorer, såsom mønstre af mekanisk belastning, med høj statistisk konfidens. Denne teknik, sammen med datamodellering, er allerede blevet anvendt til at bestemme de relative bidrag fra fysiske og biokemiske signaler i vejledning af den normale udvikling af brystepitelceller væv og andre forgrenede epitel 7-11. Præsenteret her er en detaljeret protokol til opbygning disse model væv, som let kan udvides til andre typer af celler og ekstracellulær matrix (ECM) geler, og som tjener som et potentielt værktøj til test af terapeutiske midler.
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, og Burroughs Velkommen fonden. ASP blev delvist understøttet af en Charlotte Elizabeth Procter hædrende Fellowship.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |