Summary

Engineering Tredimensionale epitelvæv indlejret i ekstracellulær matrix

Published: July 10, 2016
doi:

Summary

Dette håndskrift beskriver en blød litografi-baseret teknik til at konstruere ensartede arrays af tredimensionale (3D) epitelvæv med defineret geometri omgivet af ekstracellulær matrix. Denne metode kan underkastes en lang række celletyper og eksperimentelle sammenhænge og giver mulighed for high-throughput screening af identiske gentagelser.

Abstract

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

Introduction

Udviklingen af ​​forgrenede epitelvæv, kendt som forgrening morfogenese, reguleres af celleafledte, fysiske og miljømæssige faktorer. I mælkekirtlen, forgrening morfogenese er en iterativ proces, hvorigennem styret kollektiv cellemigrering skaber en trælignende arkitektur. Det første skridt er primære knop dannelse fra mælkekanalerne, efterfulgt af gren initiering og forlængelse 1,2. Invasion af grene i det omgivende stroma induceres af den systemiske afgivelse af steroidhormoner ved puberteten. Nye primære knopper derefter starter fra enderne af eksisterende filialer, og denne proces fortsætter med at skabe en epitelial træ 3. Selv om der er identificeret mange vigtige biokemiske signaler, en omfattende forståelse af cellens biologiske mekanismer, der styrer denne komplekse udviklingsproces øjeblikket mangler. Desuden mekanistiske undersøgelser af påvirkninger af specifikke signaler er vanskelige at dekonstruere fra erfamenter in vivo, så præcise spatiotemporale forstyrrelser og målinger er ofte ikke muligt.

Tre-dimensionelle (3D) kultur teknikker, såsom hele orgel kultur, primære organoids, og cellekultur modeller, er nyttige værktøjer til systematisk at undersøge mekanismerne bag vævsmorfogenese 4-6. Disse kan være særligt nyttige til bestemmelse af påvirkninger af specifikke faktorer enkeltvis, såsom mekaniske kræfter og biokemiske signaler, på en række celle- adfærd, herunder migration, proliferation og differentiering. 6 Engineered cellekulturmodeller, navnlig let aktivere den forstyrrelse af individuelle celler og deres mikromiljø.

Én sådan kultur model bruger en mikrofabrikation tilgang til ingeniør model brystepitelceller væv med kontrolleret 3D-struktur, der konsekvent og reproducerbart danner grene, der vandrer kollektivt ved induktion med enppropriate vækstfaktorer. Den største fordel ved modellen er evnen til præcist at manipulere og måle effekterne af fysiske og biokemiske faktorer, såsom mønstre af mekanisk belastning, med høj statistisk konfidens. Denne teknik, sammen med datamodellering, er allerede blevet anvendt til at bestemme de relative bidrag fra fysiske og biokemiske signaler i vejledning af den normale udvikling af brystepitelceller væv og andre forgrenede epitel 7-11. Præsenteret her er en detaljeret protokol til opbygning disse model væv, som let kan udvides til andre typer af celler og ekstracellulær matrix (ECM) geler, og som tjener som et potentielt værktøj til test af terapeutiske midler.

Protocol

1. Fremstilling af opløsninger Til fremstilling af en 5 mg / ml opløsning af insulin, fortyndes den pulveriserede insulin lager med 5 mM saltsyre (HCI) i dH2O (500 mg insulin i 100 ml opløsningsmiddel). Fremstilling af 100 ml opløsningsmiddel ved tilsætning af 50 pi koncentreret HCI til 100 ml destilleret vand (dH 2 O). For at gøre en 1x opløsning af PBS, fortyndes 10x phosphatbufret saltvand (PBS) stamopløsning til 1x med dH2O under sterile betingelser. </li…

Representative Results

Oversigtsdiagram af mamma-epitelvæv mikrofabrikation En generel skematisk af mikrofabrikation procedure skitserer det eksperimentelle arbejde flow er vist i figur 1. Slutresultatet er en vifte af epitelvæv med identisk geometri og afstand, der er fuldstændig indlejret i en ECM gel. Et repræsentativt eksperiment anvender EpH4 musebryst epitelceller dyrket i en gel af bovin type I collagen i en koncentration på 4 mg / ml. …

Discussion

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, og Burroughs Velkommen fonden. ASP blev delvist understøttet af en Charlotte Elizabeth Procter hædrende Fellowship.

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184
PDMS curing agent Ellsworth Adhesives Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master self-made N/A
Plastic weigh boat Fisher Scientific 08-732-115
100-mm-diameter Petri dishes BioExpress D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O
Razor blade American Safety Razor 620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) Hyclone SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14185-052
Insulin Sigma Aldrich I6634-500MG
Gentamicin Life Technologies 15750-060
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399-500
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 221465-500G
Bovine type I collagen (non-pepsinized) Koken IAC-50
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich A-7906
Curved stainless steel tweezers Dumont 7
35-mm-diameter tissue culture dishes BioExpress T-2881-6
15 mL conical tubes BioExpress C-3394-2
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube USA Scientific 1615-5500
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter Bellco Glass Inc. Special order
0.05% 1X Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Paraformaldehyde VWR 100503-916
Triton X-100 Perkin Elmer N9300260 Detergent
HGF Sigma Aldrich H 9661 Resuspended in dH2O at 50 mg/mL
Rabbit anti-mouse FAK antibody Life Technologies AMO0672
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Life Technologies A-11034
Adobe Photoshop Adobe N/A Used for color-coding pixel frequency maps.
FIJI (ImageJ) NIH N/A Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.

References

  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
  3. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  4. Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
  5. Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
  6. Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
  7. Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
  8. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
  10. Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
  11. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
  12. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  13. Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
  14. Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
check_url/kr/54283?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. M. Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (113), e54283, doi:10.3791/54283 (2016).

View Video