Ingénierie en trois dimensions des tissus épithéliaux incorporés au sein de la matrice extracellulaire
Summary
Ce manuscrit décrit une technique à base de lithographie douce pour concevoir des tableaux uniformes en trois dimensions (3D) tissus épithéliaux de géométrie définie entourées par la matrice extracellulaire. Cette méthode se prête à une grande variété de types de cellules et dans des contextes expérimentaux et permet un criblage à haut débit de répétitions identiques.
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
Le développement des tissus épithéliaux ramifiés, appelés morphogenèse de ramification, est régi par, et des facteurs environnementaux physiques dérivés de cellules. Dans la glande mammaire, la morphogenèse de ramification est un processus itératif par lequel guidé la migration cellulaire collective crée une architecture arborescente. La première étape est la formation des bourgeons primaires des conduits de lait, suivi par branche d' initiation et de l' allongement de 1,2. Invasion des branches dans le stroma environnant est induite par la libération systémique des hormones stéroïdes à la puberté. Les nouveaux bourgeons primaires déclenchent alors des extrémités des branches existantes, et ce processus continue de créer un arbre épithéliales 3. Bien que de nombreux signaux biochimiques importants ont été identifiés, une compréhension globale des mécanismes cellulaires biologiques qui guident ce processus complexe du développement fait actuellement défaut. En outre, des études mécanistiques sur les influences des indices spécifiques sont difficiles à déconstruire de expéments in vivo, des perturbations et des mesures spatio – temporelles aussi précises ne sont souvent pas possible.
En trois dimensions (3D) des techniques de culture, telles que la culture ensemble d'organes, organites primaires, et des modèles de culture cellulaire, sont des outils utiles pour enquêter systématiquement sur les mécanismes sous – jacents de la morphogenèse des tissus 4-6. Ceux – ci peuvent être particulièrement utiles pour déterminer l'influence des facteurs spécifiques individuellement, telles que des forces mécaniques et des signaux biochimiques, sur une variété de comportements cellulaires, y compris la migration, la prolifération et la différenciation. 6 modèles de culture cellulaire d' ingénierie, en particulier, facilement activer la perturbation des cellules individuelles et leur microenvironnement.
Un tel modèle de culture utilise une approche basée sur la microfabrication à concevoir le modèle des tissus épithéliales mammaires avec structure 3D contrôlée qui forment de manière cohérente et reproductible branches qui migrent collectivement lorsque induite par l'unles facteurs de croissance ppropriate. Le principal avantage de ce modèle est la possibilité de manipuler avec précision et de mesurer les effets des facteurs physiques et biochimiques, tels que les modèles de contrainte mécanique, avec confiance statistique élevé. Cette technique, ainsi que la modélisation informatique, a déjà été utilisé pour déterminer les contributions relatives des signaux physiques et biochimiques dans la direction du développement normal des tissus épithéliales mammaires et d' autres épithéliums ramifiés 7-11. Présenté ici est un protocole détaillé pour la construction de ces tissus de modèles, qui peuvent être facilement étendues à d'autres types de cellules et la matrice extracellulaire (ECM) de gels, et qui sert comme un outil potentiel pour les essais de produits thérapeutiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH (HL118532, HL120142, CA187692), la Fondation David & Lucile Packard, Camille & Fondation Henry Dreyfus, et Burroughs Bienvenue Fonds. ASP a été soutenu en partie par une Charlotte Elizabeth Procter Honorifique Fellowship.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
