Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

Summary

Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.

Abstract

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

Introduction

O desenvolvimento de tecidos epiteliais ramificada, conhecidos como ramificação morfogênese, é regulado por, e fatores ambientais físicas derivadas de células. Na glândula mamária, ramificação morfogênese é um processo iterativo pelo qual guiou a migração de células coletiva cria uma arquitetura de árvore. O primeiro passo é a formação de gemas primário dos canais de leite, seguido pela iniciação e alongamento ramo ^1,2. Invasão de filiais no estroma circundante é induzida pela liberação sistêmica de hormônios esteróides na puberdade. Botões novos primários, em seguida, iniciar a partir das extremidades dos ramos existentes, e este processo continua a criar uma árvore epitelial ^3. Embora muitos sinais bioquímicos importantes foram identificados, uma compreensão abrangente dos mecanismos celulares biológica que norteiam este processo de desenvolvimento complexo actualmente não existe. Além disso, estudos sobre os mecanismos sobre as influências das pistas específicas são difíceis de desconstruir a partir experimentos in vivo, perturbações e medições espaço-temporais como precisas muitas vezes não são possíveis.

Tridimensionais técnicas de cultura (3D), como a cultura inteira órgão, Organóides primários, e os modelos de cultura de células, são ferramentas úteis para investigar sistematicamente os mecanismos subjacentes morfogênese do tecido ^4-6. Estes podem ser particularmente úteis para determinar as influências de factores específicos individualmente, tais como as forças mecânicas e sinais bioquímicos, em uma variedade de comportamentos de células, incluindo migração, proliferação e diferenciação. ⁶ modelos de cultura de células modificadas geneticamente, em particular, facilmente permitir a perturbação de células individuais e o seu microambiente.

Um tal modelo de cultura utiliza uma abordagem baseada em microfabricação para manipular tecidos epiteliais mamárias modelo 3D com estrutura controlada de modo consistente e reprodutível formam ramos que migram colectivamente quando induzida com o umfactores de crescimento ppropriate. A principal vantagem do modelo é a capacidade de manipular com precisão e medir os efeitos dos factores físicos e bioquímicos, tais como padrões de esforço mecânico, com alta confiança estatística. Esta técnica, em conjunto com a modelagem computacional, já foi usado para determinar as contribuições relativas de sinais físicos e bioquímicos na orientação do desenvolvimento normal dos tecidos epiteliais mamárias e outros epitélios ramificados ^7-11. É apresentada aqui um protocolo detalhado para a construção destes tecidos modelo, que pode ser facilmente alargada a outros tipos de células e matriz extracelular (ECM) géis, e que serve como uma potencial ferramenta para o teste de agentes terapêuticos.

Protocol

1. Preparação de Soluções Para preparar uma solução a 5 mg / ml de insulina, dilui-se a base de insulina em pó com ácido clorídrico a 5 mM (HCl) em dH 2 O (500 mg de insulina em 100 ml de solvente). Preparação de 100 ml de solvente por adição de 50 ul de HCl concentrado a 100 ml de água destilada (dH2O). Para fazer uma solução de PBS 1x, dilui-se a solução de reserva 10x de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 1x com dH2O sob condiçõe…

Representative Results

Esquemática geral de microfabricação tecido epitelial mamário Um esquema geral do processo de microfabricação descrição do fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1. O resultado final é uma série de tecidos epiteliais de geometria e espaçamento idênticos que estão completamente encaixadas dentro de um gel de ECM. Uma experiência representativa utiliza rato EpH4 células epiteliais mamarias cultivada…

Discussion

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS curing agent	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master	self-made	N/A
Plastic weigh boat	Fisher Scientific	08-732-115
100-mm-diameter Petri dishes	BioExpress	D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O
Razor blade	American Safety Razor	620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1)	Hyclone	SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10X Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Bovine type I collagen (non-pepsinized)	Koken	IAC-50
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Curved stainless steel tweezers	Dumont	7
35-mm-diameter tissue culture dishes	BioExpress	T-2881-6
15 mL conical tubes	BioExpress	C-3394-2
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter	Bellco Glass Inc.	Special order
0.05% 1X Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldehyde	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergent
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Resuspended in dH2O at 50 mg/mL
Rabbit anti-mouse FAK antibody	Life Technologies	AMO0672
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Used for color-coding pixel frequency maps.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.