Summary

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Published: July 10, 2016
doi:

Summary

Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.

Abstract

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

Introduction

El desarrollo de los tejidos epiteliales ramificados, conocidos como la morfogénesis de ramificación, está regulada por factores ambientales, y derivados de células, físicos. En la glándula mamaria, la morfogénesis de ramificación es un proceso iterativo mediante el cual guiada migración celular colectiva crea una arquitectura de árbol. El primer paso es la formación de yemas primaria de los conductos de la leche, seguido de la iniciación y elongación rama de 1,2. La invasión de las ramas en el estroma circundante es inducida por la liberación sistémica de hormonas esteroides en la pubertad. Nuevos brotes primarios inician entonces desde los extremos de las ramas existentes, y este proceso continúa para crear un árbol de 3 epitelial. Aunque muchas señales bioquímicas importantes han sido identificados, una amplia comprensión de los mecanismos celulares biológica que guían este proceso complejo de desarrollo actualmente se carece. Por otra parte, los estudios sobre los mecanismos de las influencias de las señales específicas son difíciles de deconstruir de expementos in vivo, las perturbaciones y las mediciones espaciotemporales como precisas a menudo no son posibles.

(3D) de las técnicas de cultivo en tres dimensiones, como la cultura entera de órganos, organoides primarios, y modelos de cultivo celular, son herramientas útiles para investigar sistemáticamente los mecanismos que subyacen a la morfogénesis de tejidos 4-6. Estos pueden ser particularmente útiles para la determinación de las influencias de los factores específicos de forma individual, como las fuerzas mecánicas y señales bioquímicas, en una variedad de comportamientos celulares, incluyendo la migración, la proliferación y la diferenciación. 6 modelos de cultivo de células de ingeniería, en particular, permite fácilmente la perturbación de las células individuales y su microambiente.

Un tal modelo de cultivo utiliza un enfoque basado en la microfabricación para diseñar tejidos epiteliales mamarias modelo con estructura 3D controlado que consistente y reproducible forman ramas que migran colectivamente cuando se induce con la unafactores de crecimiento apropiadas, con. La principal ventaja de este modelo es la capacidad de manipular y medir los efectos de los factores físicos y bioquímicos, tales como los patrones de tensión mecánica, con alta confianza estadística precisa. Esta técnica, junto con modelado computacional, ya ha sido utilizado para determinar las contribuciones relativas de las señales físicas y bioquímicas en la dirección del desarrollo normal de los tejidos epiteliales mamarias y otros epitelios ramificados 7-11. Se presenta aquí es un protocolo detallado para la construcción de estos tejidos modelo, que pueden ser fácilmente extenderse a otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) geles, y que sirve como una herramienta potencial para la prueba de la terapéutica.

Protocol

1. Preparación de soluciones Para preparar una solución de 5 mg / ml de insulina, se diluye la insulina de stock en polvo con 5 mM de ácido clorhídrico (HCl) en dH 2 O (500 mg de insulina en 100 ml de disolvente). Preparar 100 ml de disolvente mediante la adición de 50 l de HCl concentrado a 100 ml de agua destilada (dH2O). Para hacer una solución de PBS 1x de, diluir la solución madre 10x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1x con dH2O en condicion…

Representative Results

Esquemática general de microfabricación tejido epitelial mamaria Un esquema general del procedimiento de microfabricación esbozar el flujo de trabajo experimental se muestra en la Figura 1. El resultado final es una matriz de los tejidos epiteliales de la geometría idéntica y el espaciamiento que se incrustan completamente dentro de un gel de ECM. Un experimento representativo utiliza células epiteliales mamarias EpH4 d…

Discussion

The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH (HL118532, HL120142, CA187692), la Fundación David y Lucile Packard, la Fundación Camille y Henry Dreyfus, y el Burroughs Bienvenido Fondo. ASP fue apoyado en parte por una Charlotte Elizabeth Procter honorífico de becas.

Materials

Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184
PDMS curing agent Ellsworth Adhesives Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master self-made N/A
Plastic weigh boat Fisher Scientific 08-732-115
100-mm-diameter Petri dishes BioExpress D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O
Razor blade American Safety Razor 620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) Hyclone SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14185-052
Insulin Sigma Aldrich I6634-500MG
Gentamicin Life Technologies 15750-060
10X Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399-500
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 221465-500G
Bovine type I collagen (non-pepsinized) Koken IAC-50
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich A-7906
Curved stainless steel tweezers Dumont 7
35-mm-diameter tissue culture dishes BioExpress T-2881-6
15 mL conical tubes BioExpress C-3394-2
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube USA Scientific 1615-5500
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter Bellco Glass Inc. Special order
0.05% 1X Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Paraformaldehyde VWR 100503-916
Triton X-100 Perkin Elmer N9300260 Detergent
HGF Sigma Aldrich H 9661 Resuspended in dH2O at 50 mg/mL
Rabbit anti-mouse FAK antibody Life Technologies AMO0672
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Life Technologies A-11034
Adobe Photoshop Adobe N/A Used for color-coding pixel frequency maps.
FIJI (ImageJ) NIH N/A Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.

References

  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
  3. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  4. Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
  5. Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
  6. Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
  7. Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
  8. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
  10. Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
  11. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
  12. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  13. Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
  14. Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
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Cite This Article
Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. M. Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (113), e54283, doi:10.3791/54283 (2016).

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