Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
El desarrollo de los tejidos epiteliales ramificados, conocidos como la morfogénesis de ramificación, está regulada por factores ambientales, y derivados de células, físicos. En la glándula mamaria, la morfogénesis de ramificación es un proceso iterativo mediante el cual guiada migración celular colectiva crea una arquitectura de árbol. El primer paso es la formación de yemas primaria de los conductos de la leche, seguido de la iniciación y elongación rama de 1,2. La invasión de las ramas en el estroma circundante es inducida por la liberación sistémica de hormonas esteroides en la pubertad. Nuevos brotes primarios inician entonces desde los extremos de las ramas existentes, y este proceso continúa para crear un árbol de 3 epitelial. Aunque muchas señales bioquímicas importantes han sido identificados, una amplia comprensión de los mecanismos celulares biológica que guían este proceso complejo de desarrollo actualmente se carece. Por otra parte, los estudios sobre los mecanismos de las influencias de las señales específicas son difíciles de deconstruir de expementos in vivo, las perturbaciones y las mediciones espaciotemporales como precisas a menudo no son posibles.
(3D) de las técnicas de cultivo en tres dimensiones, como la cultura entera de órganos, organoides primarios, y modelos de cultivo celular, son herramientas útiles para investigar sistemáticamente los mecanismos que subyacen a la morfogénesis de tejidos 4-6. Estos pueden ser particularmente útiles para la determinación de las influencias de los factores específicos de forma individual, como las fuerzas mecánicas y señales bioquímicas, en una variedad de comportamientos celulares, incluyendo la migración, la proliferación y la diferenciación. 6 modelos de cultivo de células de ingeniería, en particular, permite fácilmente la perturbación de las células individuales y su microambiente.
Un tal modelo de cultivo utiliza un enfoque basado en la microfabricación para diseñar tejidos epiteliales mamarias modelo con estructura 3D controlado que consistente y reproducible forman ramas que migran colectivamente cuando se induce con la unafactores de crecimiento apropiadas, con. La principal ventaja de este modelo es la capacidad de manipular y medir los efectos de los factores físicos y bioquímicos, tales como los patrones de tensión mecánica, con alta confianza estadística precisa. Esta técnica, junto con modelado computacional, ya ha sido utilizado para determinar las contribuciones relativas de las señales físicas y bioquímicas en la dirección del desarrollo normal de los tejidos epiteliales mamarias y otros epitelios ramificados 7-11. Se presenta aquí es un protocolo detallado para la construcción de estos tejidos modelo, que pueden ser fácilmente extenderse a otros tipos de células y la matriz extracelular (ECM) geles, y que sirve como una herramienta potencial para la prueba de la terapéutica.
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH (HL118532, HL120142, CA187692), la Fundación David y Lucile Packard, la Fundación Camille y Henry Dreyfus, y el Burroughs Bienvenido Fondo. ASP fue apoyado en parte por una Charlotte Elizabeth Procter honorífico de becas.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |