Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular
Summary
Bu yazıda, üç boyutlu (3D) tek tip diziler ekstraselüler matriks çevrili tanımlanan geometri epitel doku mühendisi yumuşak litografi tabanlı teknik anlatılmaktadır. Bu yöntem, hücre tipleri ve deneysel bağlamlarda çeşitli için uygun olan ve aynı çoğaltır yüksek verimli tarama sağlar.
Abstract
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Introduction
morfojenezi dallanma olarak bilinen kollara ayrılmış epitelyal dokuların gelişimi, hücre-türevli, fiziksel ve çevresel faktörler ile düzenlenir. meme bezinde, morfolojilerinden dallanma toplu hücre göçü bir ağaç gibi mimari oluşturur güdümlü aracılığıyla tekrarlanan bir süreçtir. İlk adım şube başlatılması ve uzama 1,2 izledi süt kanallarından birincil tomurcuğu oluşumu vardır. Çevredeki stromaya dalları Invasion ergenlik steroid hormonların sistemik salınımı ile indüklenir. Yeni birincil tomurcukları sonra varolan şube uçlarından başlatabilir ve bu süreç bir epitel ağacı 3 yaratmaya devam ediyor. Birçok önemli biyokimyasal sinyaller tespit edilmiş olmasına rağmen, bu karmaşık gelişim süreci şu anda eksiktir rehberlik hücre biyolojik mekanizmaların kapsamlı bir anlayış. Ayrıca, belirli ipuçlarının etkilere mekanik çalışmalar deney gelen yapısızlaştırmak zorin vivo likte olarak hassas uzaysal tedirginlikler ve ölçümler çoğu zaman mümkün değildir.
Böyle tüm organ kültürü, birincil organoids ve hücre kültür modelleri gibi üç boyutlu (3D) kültür teknikleri, sistematik doku morfolojilerinden 4-6 yatan mekanizmaları araştırmak için yararlı araçlardır. Bu hareketi, çoğalması ve farklılaşması dahil olmak üzere hücre davranışları çeşitli, bu gibi mekanik güçler ve biyokimyasal sinyallerin gibi, tek tek özel faktörlerin etkileri belirlemek için yararlı olabilir. 6 tasarlanan hücre kültürü modelleri, özellikle, hali hazırda pertürbasyon etkinleştirmek tek tek hücreler ile bunların mikro arasında.
Böyle bir kültür modeli a ile uyarılan zaman tutarlı ve tekrarlanabilir toplu göç dalları oluşturan kontrollü 3D yapısı ile örnek meme epitel doku mühendisi bir mikroüretim tabanlı bir yaklaşım kullanırppropriate büyüme faktörleri. modelin en büyük avantajı tam işlemek ve bu tür yüksek istatistiksel güven ile mekanik stres desen, fiziksel ve biyokimyasal faktörlerin etkilerini ölçmek için yeteneğidir. Bu teknik, bir araya hesaplama modelleme ile, daha önce meme epitelyal dokusunda ve dallı epitel 7-11 normal gelişimin rehberliğinde fiziksel ve biyokimyasal sinyallerin nispi katkılarını belirlemek için kullanılmıştır. Burada sunulan kolaylıkla hücreler ve hücre-dışı matrisi (ECM) jellerin diğer tiplerinin uzatılabilir, bu model, dokular, bina için ayrıntılı bir protokoldür ve terapötiklerinin test edilmesi için potansiyel bir araç olarak hizmet eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David ve Lucile Packard Vakfı, Camille ve Henry Dreyfus Vakfı ve Burroughs hibe tarafından kısmen desteklenmiştir Fonu hoş geldiniz. ASP Charlotte Elizabeth Procter yüceltici Kardeşliği tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
