成体ラットから無傷の後根神経節上のパッチクランプ記録
Summary
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
後根神経節（DRG）を切り出し、神経細胞からのパッチクランプ研究は、末梢神経系の我々の理解が高まっています。現在、レコーディングの大部分は、ほとんどの研究室のための標準的な製剤である解離DRGニューロン上で行われています。ニューロンの特性は、しかしながら、解離したニューロンを取得する際に用いられる酵素消化から生じる軸索損傷によって変更することができます。一次感覚ニューロンを取り囲む衛星グリア細胞との接触の損失は、この方法の避けられない結果であるので、解離ニューロン製剤は完全にDRGの微小環境を表すことができません。パッチクランプ記録のために、従来の解離DRGニューロンを使用して制限を克服するために、この報告書では、我々は、ex vivoで 、無傷のDRGを作成し、個々の一次感覚ニューロンにパッチクランプ記録を行う方法について説明します。このアプローチはで模倣、無傷のDRGの高速かつ簡単な製造を可能その周囲の衛星グリア細胞と基底膜に関連したDRGニューロンを維持することにより、インビボ条件。さらに、この方法は、操作からの軸索の損傷を回避し、そのようなDRGを解離するときのように消化酵素。このエクスビボ製剤はさらに、一次感覚ニューロンおよび衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために使用することができます。
Introduction
センセーションは、生物の生存と福祉に不可欠です。刺激の伝達は、一次感覚ニューロンからの軸索の末梢終末から始まる感覚経路に依存しています。一次感覚ニューロンは、三叉神経の脳核を除いて、三叉神経節および後根神経節（DRG）内に配置されています。彼らは、感覚情報1のゲートキーパーとして機能します。 perikarial膜では、ちょうど中枢および末梢端子のように、DRGニューロンは、グルタミン酸受容体として、受容体及びイオンチャネルを発現し、TNFアルファ受容体、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）、ナトリウムチャネルなど 2 -7。 perikarial膜のパッチクランプ記録は、ニューロン全体でこれらの受容体およびチャネルの多くの機能的変化を理解することができます。
パッチクランプ記録技術は、STUのための強力なツールです。チャネルもしくは受容体および研究の多くの活動を瀕死はDRGニューロン8-10にこの技術を適用することによって行われています。ほとんどの研究ではDRGは、背側根神経節に近い脊髄神経を切断することによって除去されます。ミンチした後、神経節は、次いで、記録する前に数日間、直ちにまたは培養記録されていてもよいDRGニューロンの解離をもたらす消化酵素に配置されます。残念ながら、DRGニューロンの解離はperikaryonの複数形に近い必要な軸索切断を伴います。いったん分離し、軸索切断し、DRGニューロンは、膜興奮11,12における表現型の変化だけでなく、変化を受けます。通常はそれらを囲む個々のニューロンのperikaryonの複数形及び衛星グリア細胞間の接触の損失は、これらの変化13に貢献する可能性があります。ニューロンと衛星グリア細胞間のクロストークは、生理的条件下において必須とpathologへの適応の両方でありますこのような難治性疼痛14,15につながるものとiCalの条件。解離したDRGの準備を使用して、ニューロンと衛星グリア細胞間の相互作用を研究するために挑戦することになります。
無傷のDRGを、一方、 インビボ条件に近い提供します。過去数年間で、私たちの研究室だけでなく、いくつかの他のグループは、慢性疼痛3-5,11,15-17に関連したさまざまな条件での一次感覚ニューロンの変化を調査するために成体ラットから無傷のDRGを使用しています。これらの研究で使用される技術は多少確立されていますが、ステップバイステップの説明がまだ公開されていません。本原稿では、我々は、無傷のDRGおよびパッチクランプ記録のためのそれらの使用を準備するための便利で高速な方法を記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、パッチクランプ研究のための全体のDRGを調製するための方法を報告しています。理想的な試料を調製するためのいくつかの重要な要素があります。第一に、添付の背側根でのDRGを分析することが重要です。その後、神経上膜は、ニューロンへの損傷を回避しながら慎重に除去する必要があります。最終的に、ニューロンおよびその周囲の衛星グリア細胞が露出するように、残りの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
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