핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법
Summary
우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.
Abstract
FINA 핵산 여과 분리 미만에서 2 분에 전혈 세포에서 DNA를 추출 분리막 및 흡수 패드를 통해 여과에 수직을 이용하는 신규 추출법이다. 혈액 시료는 세제 혼합 간단히 처리 및 분리막을 피펫에 의해 적용된다. 해물이 분리막의 표면에, 게놈 DNA를 캡처, 모세관 현상에 의한 블롯 패드에 심지. 추출 된 DNA는 PCR 억제제 흡수 블롯 패드에 악 상기 간단한 세척 단계 동안 막에 유지된다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 추가의 정제없이 PCR 반응에 첨가된다. 이러한 간단한 방법은 실험 장비를 필요로하지 않고 쉽게 저렴 실험실 용품으로 구현 될 수있다. 여기에서 우리는 초기의 모델로 100 μL 전체 혈액에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 고감도 검출 및 정량을위한 프로토콜을 설명쉽게 다른 유전 적 목표에 적용 할 수있는 HIV의 영아 진단.
Introduction
여러 보고서를 모두 사용할 수있는 절묘한 감성과 분자 진단의 특이성을 목적으로 현장 진료 (POC) 장치 1-5 사용하기 위해 종이 – 또는 멤브레인 기반 추출 방법의 개발을 논의했다. 세계 보건기구 (WHO) 성병 진단 이니셔티브는 POC의 (경제적, 민감한, 특정, 사용자 친화적 인, 신속하고 강력한 장비가없는 그것을 필요로하는 사람들 배달)을 설명하는 이상적인 특성 안심 용어를 만들어 낸 시험 6. 이 가이드 라인 중 장비가없는 특징은 분자 진단 달성하기 위해 특히 도전이다. 그러나, 필드에있는 모든 혁신은 가장 필요로하는 사람들을 도달 목표를 진행하며, 희망은 기존의 기술 (7)을 적용하여 테스트 성능을 단기적 개선이 있습니다.
여기에서 우리는 전체 혈액에서 DNA를 추출하는 간단한 프로토콜을 설명그 복잡한 화학 또는 실험실 장비를 필요로하지 않습니다. FINA (핵산 여과 분리) 시료의 제조 방법은 원래 샘플에 응답 케어 포인트 (POC)의 일부 정량적 PCR 같이 HIV-1 프로 바이러스를 검출하기 위해 전혈로부터 백혈구 DNA를 추출하기 위해 개발 된 제한된 리소스 설정 8-11에 사용 (qPCR에) 초기 유아 진단 (EID) 플랫폼입니다. FINA 추출 가역적 카오 트로픽 제 (12)의 존재 하에서 DNA 결합 실리카 막, 실리카 코팅 된 상자성 입자를 사용하는 종래의 정제 방법과 다르다. 대신, FINA 직접 전체 혈액에서 세포의 DNA를 추출하기 위해 분리막을 통해 수직 여과를 사용합니다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 PCR 튜브에 직접 배치 및 하나 이후 즉시 증폭 9 건조 PCR 반응 또는 공기를 사용할 수있다. 어떤 카오 트로픽 제, 페놀 또는 알코올이 샘플의 추출에 이용되지 않으며, elimina팅 추출 처리 (13, 14)로부터 유도 qPCR의 강력한 억제제를 제거하기 위해 필요한 광범위한 세척 단계.
FINA 막을 시험편 멤브레인에 추가되기 전에 세포 용해 (11)에 의해 해방 된 세포 중 9 또는 게놈 DNA를 포착 할 수있다. 셀 캡처, 전체 피가 막에 직접 추가됩니다. 세포를이어서 10 mM의 수산화 나트륨을 첨가함으로써 막에 용해된다. 이 방법의 장점은 단지 3 단계를 포함하는 것이있다 : 1) 샘플을 첨가하는 단계; qPCR에 관 2) 세포 용해 / 세척 및 3) 필터 디스크 위치. 이 방법의 단점은 막 만의 막 디스크의 직경에 비례 셀들의 정의 된 번호를 저장할 수 있다는 것이다. EID 필요한 검출 한계에 도달하기 전혈 100 μL은 qPCR에 튜브를 배치하기에 너무 큰 필터를 수반 샘플 입력을 요구한다. 컬렉션에 추가하기 전에 샘플을 세제로 혈액 세포를 용균막을 처리하는 단계를 추가하지만 동일한 샘플 크기보다 작은 필터를 사용할 수있다. 우리는 높은 재현성, 단일 복사본 검출하고,이 테스트 구성 (11)를 사용하여 혈액 100 ㎕에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 한 작은 10 복사본의 정량을 입증 할 수 있었다.
이 보고서에서 우리는 원래 실험실 사용하기 위해 개발로 FINA 프로토콜을 설명합니다. FINA 시료 전처리 모듈로 알려진 막 / 필터 샌드위치 큰 일괄 적으로 준비하고 나중에 사용하기 위해 비축 할 수있다. 표본 경우이 과정이 2 분 소요 크기의 배치를 변화에서 수행 할 수 있습니다 추출 할 수 있습니다. qPCR에 바로 실행될 수 있거나 qPCR을 수행하는 것이 편리 할 때까지 삽입 된 DNA를 함유하는 필터를 저장할 수있다. 이 방법은 낮은과 높은 리소스 설정 모두에서 시료의 일상적인 분석을위한 매우 편리합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
빠른 치료 액세스 링크 EID 의한 HIV 감염 16 유아 사망률 감소하는 것으로 입증되었다. 때문에 유아의 혈액 모체 항체의 지속성 신속 HIV 항체 테스트는 HIV에 노출 된 유아의 상태를 결정하는 유틸리티를 제한하고있다. 보건기구 (WHO)는 HIV-1 양성 산모에게서 태어난 모든 유아는 바이러스 학적 검사 (17)를 사용하여, 연령 4 ~ 6 주에 테스트해야하는 것이 좋습니다. 우리는 (61) 남아프리?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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