Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,
Summary
Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.
Abstract
FINA, nükleik asitlerin filtrasyon izolasyonu, en az 2 dakika içinde tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı emici ped vasıtasıyla dikey filtrasyon kullanan yeni bir ekstraksiyon yöntemi. Kan numunesi deterjan, kısa bir süre karıştırıldı ile muamele edilmiş ve ayırma membranı şekilde kamış ile uygulanır. Lizat ayırma membranı yüzeyinde genomik DNA yakalama, kılcal eylemi lekeleme pedine fitilleri. Ekstre edilen DNA, PCR inhibitörleri, emici lekeleme pedine kötü burada basit bir yıkama aşaması sırasında zar üzerinde muhafaza edilir. yakalanmış DNA içeren zar daha sonra daha fazla arıtılmadan PCR reaksiyonuna ilave edildi. Bu basit yöntem laboratuvar ekipmanı gerektirmeyen ve kolayca ucuz laboratuar malzemeleri ile uygulanabilir. Burada erken için bir model olarak, 100 ul tam kandan, HIV-1 proviral DNA'nın son derece hassas algılama ve miktar tayini için bir protokol açıklarkolayca diğer genetik hedeflere adapte olabilir HIV fant tanı.
Introduction
Çeşitli raporlar, herkes için ulaşılabilir zarif duyarlılığı ve moleküler tanı özgüllüğünün yapma hedefiyle noktası-bakım (POC) aygıtları 1-5 kullanım için, kağıt veya membran bazlı ekstraksiyon yöntemleri geliştirilmesini ele aldık. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Cinsel Yolla Bulaşan Hastalıklar Tanı Girişimi POC (Ekonomik, Hassas, Özgül, kullanıcı dostu, hızlı ve sağlam, Ekipman-özgür ve ihtiyacı olanlara teslim) tanımlamak için idealdir özellikleri ASSURED terim icat Test 6. Bu yönergelerin, ekipman gerektirmeyen karakteristik moleküler teşhis için elde etmek özellikle zordur. Bununla birlikte, sahada her yenilik en çok ihtiyacı olanlara ulaşma hedefine ilerlemek olacak ve umut mevcut teknoloji 7 adapte test performansında yakın vadeli iyileştirmeler için vardır.
Burada kandan DNA ayıklamak için basit bir protokol açıklarkarmaşık kimya veya laboratuar aletleri gerekli değildir. FINA (nükleik asitlerin filtrasyon izolasyon) örnek hazırlama yöntemi ilk olarak, bir örnek-yanıt noktası bakım (POC) bir parçası nicel PCR HIV-1 provirüsü tespit etmek için tam kan lökosit DNA elde etmek için geliştirilmiştir sınırlı kaynak ayarlarını 8-11 kullanılmak üzere (qPCR) erken bebek teşhis (EID) platformu. FINA ekstraksiyon tersine çevrilebilir kaotropik ajanların 12 varlığında DNA bağlama silika membranlar veya silis kaplı paramanyetik parçacıkları kullanan geleneksel saflaştırma yöntemleri farklıdır. Bunun yerine, FINA doğrudan tam kandan, hücresel DNA elde etmek için, bir ayırma membranı üzerinden dikey filtrasyon kullanır. Yakalanmış DNA içeren zar bir PCR tüpü içinde doğrudan yerleştirilmiş ve ya hemen sonraki amplifikasyon 9 kurutuldu bir PCR reaksiyonunda veya hava da kullanılabilir. Resim kaotropik maddeler, fenol ya da alkoller, numûne alma kullanılır, Eliminating çıkarma işlemi 13,14 türetilen güçlü qPCR inhibitörleri kaldırmak için gerekli geniş yıkama adımları.
FINA Membran örneği, zara ilave edilmeden önce, hücre lizizi 11 tarafından serbest ya hücrelerinin 9 ya da genomik DNA yakalayabilir. hücre yakalama için, tam kan membranına doğrudan ilave edilir. Hücreler daha sonra 10 mM NaOH eklenerek zarda lizlenir. Bu yöntemin avantajı, sadece 3 etapları kapsar: 1) Örnek ilave; qPCR tüpünde 2) hücre parçalama / yıkama ve 3) filtre diski yerleştirme. Bu yöntemin dezavantajı, membran yalnızca membran diskin çapı ile doğrudan orantılı bir hücre belirli sayıda basılı olabilir. Eid gerekli saptama limitini ulaşmak için, tam kan, 100 ul qPCR tüp yerleştirilmesi için çok büyük bir filtre gerektirir Örnek girişi için gereklidir. koleksiyonuna örneğini uygulamadan önce bir deterjanla kan hücrelerinin lizeMembran, bir işlem adımını ekler, aynı numune boyutu için daha küçük bir filtre kullanımına izin verir. Biz yüksek tekrarlanabilirlik, tek kopya algılama ve bu test konfigürasyonu 11 kullanılarak kanın 100 ul HIV-1 proviral DNA kadar az 10 kopya ölçümünü göstermek başardık.
Bu yazıda, başlangıçta laboratuar kullanımı için geliştirilen FINA protokol açıklar. FINA örnek hazırlama modülü olarak bilinen membran / filtre sandviç büyük gruplar halinde hazırlanmış ve daha sonra kullanılmak üzere stoklanmış edilebilir. örnekler, bu işlem 2 dakika sürer ve boyut toplu değişen gerçekleştirilebilir ekstre edilmesi. qPCR hemen çalıştırılabilir veya qPCR gerçekleştirmek için uygun kadar gömülü DNA içeren filtreler saklanabilir. Bu yöntem, düşük ve yüksek kaynak ayarlarında hem numunelerin rutin analizler için çok uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hızlı tedavi erişimine bağlı EID nedeniyle HIV enfeksiyonuna 16 bebek ölümlerini azaltmak için ortaya konmuştur. Çünkü bir bebeğin kanında anne antikorların kalıcılığı, hızlı HIV antikor testleri, HIV-maruz kalan bebeklerin durumunu belirlemede yarar sınırlıdır. DSÖ, HIV-1 pozitif annelerden doğan tüm bebeklerin bir virolojik testi 17 kullanılarak, yaş 4-6 hafta test edilmelidir önerir. Biz 61 Güney Afrikalı bebekler 11 küçük alan değerlendirmesinde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol development was supported by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health grant 37774. Real-time PCR reagents and advice were provided by Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. 8E5-LAV cells were provided by the Virology Quality Assurance Laboratory, Rush Presbyterian; St. Luke’s Medical Center. HIV-1 negative blood was provided by Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Thanks to Mark Fisher for photography help.
Materials
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. “Paper Machine” for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. . Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. . Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- . . World Health Organization. , (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots–preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
