Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

Summary

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Abstract

A proteína estrutural do VIH-1, Pr55 ^{da mordaça} (ou GAG), liga-se à membrana plasmática em células durante o processo de montagem do vírus. ligação de Gag membrana é um passo essencial para a formação de partículas de vírus, uma vez que um defeito no resultado de ligação à membrana da mordaça em grave comprometimento da produção de partículas virais. Para obter detalhes mecanísticos de interacções da membrana Gag-lipídicos, e métodos in vitro com base em RMN, a pegada de proteína, ressonância de plasma de superfície, a centrifugação dos lipossomas de flutuação, ou grânulo fluorescência ligação de lípidos têm sido desenvolvidos até agora. No entanto, cada um destes métodos in vitro tem as suas limitações. Para ultrapassar algumas destas limitações e proporcionar uma abordagem complementar com os métodos previamente estabelecidos, foi desenvolvido um ensaio in vitro em que as interacções entre o HIV-1 gag e membranas lipídicas ter lugar num ambiente de "célula-like". Neste ensaio, Gag ligação a membranas lipídicas é visualmente analisadas usando-YFP Tagged Gag sintetizado em um germe de trigo baseada no sistema de tradução in vitro e GUVs preparados por uma técnica da eletroformação. Aqui nós descrevemos os antecedentes e os protocolos para obtenção de proteínas da mordaça completos com ácido mirístico e membranas GUV necessárias para o ensaio e para detectar Gag-GUV ligação por microscopia.

Introduction

vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é um vírus com envelope que monta a e gomos a partir da membrana plasmática (PM) na maior parte dos tipos de células. A montagem do HIV-1 partículas de vírus é conduzida por a proteína de núcleo virai de 55 kDa chamado Pr55 ^Gag (GAG). Gag é sintetizado como um precursor de poliproteina composto por quatro domínios estruturais principais, isto é, matriz, da cápside, nucleocápside, e P6, bem como dois péptidos espaçadores SP1 e SP2. Durante a montagem, o (MA) de domínio matriz é responsável pelo direcionamento de mordaça para o local de montagem, o capsídeo (CA) de domínio medeia interações-Gag Gag, o (NC) de domínio nucleoc�side recruta RNA genômico viral, e fatores do hospedeiro p6 recrutas que auxiliam vírus cisão de partícula a partir da membrana plasmática. Gag também sofre uma modificação co-translacional pela adição de um ácido gordo de 14 carbonos ou radical miristato na sua extremidade N-terminal.

ligação de Gag membrana é um requisito essencial para a montagem viral, uma vez que mutants que são defeituosos na ligação à membrana não produzem partículas virais. Nós e outros autores mostraram que a ligação de gag é mediada por sinais bipartidos dentro do domínio MA membrana: a porção miristato de N-terminal que medeia interacções hidrófobas com a bicamada lipídica e um aglomerado de resíduos básicos dentro do domínio MA denominado como região altamente básica ( HBR) que interage com lípidos ácidas sobre o PM ^1-4. Estudos de gag-membrana interacções utilizando a expressão ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), uma enzima que catalisa a hidrólise do fosfolípido phosphatidylinositol- ácida PM-específico (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P _2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, em células sugeriram que Gag-AM localização é mediada por PI (4,5) P ₂ ^3,5. No entanto, estudos in vitro visando a entender mais detalhes mecanicistas de Gag-PI (4,5) P ₂ interações têm provado ser um desafio para um número de razões. Paraexemplo, a purificação de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 por experiências bioquímicas tem sido tecnicamente difícil, pelo menos em parte, devido à tendência de Gag para agregar durante a purificação. Assim, as formas truncadas de HIV-1 da mordaça, tais como Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou a forma não-miristoiladas têm sido frequentemente utilizada em estudos que necessitam de purificação da mordaça (por exemplo, ressonância magnética nuclear, a pegada de proteína, e a superfície ressonância de plasma de ^6-9). Alternativamente, acoplados em reacções de transcrição-tradução in vitro têm sido utilizados para produzir de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 em outros estudos bioquímicos ^1,2. Tipicamente neste sistema, um plasmídeo Gag-codificação é transcrita e traduzida com lisados ​​de células eucarióticas (por exemplo, os lisados ​​de reticulócitos de coelho) que são desprovidas de quaisquer membranas celulares e RNAs mensageiros mas contêm os mecanismos de transcrição e tradução. Após a reacção, os lisados ​​de células que contêm gag são misturados com membranes para análise das interações da mordaça com lipídios. Além da facilidade de preparação de comprimento completo miristoilada Gag, os métodos que utilizam o sistema de tradução in vitro de transcrição têm uma vantagem que a síntese de gag e reacções de ligação à membrana posterior ocorrer num meio 'eucariótica citosol-like ", que podem representar melhor as condições fisiológicas. Esta propriedade contribuiu para os estudos que mostraram que as moléculas de RNA ligadas ao domínio MA regular Gag ligação a lípidos ácidas de forma competitiva ^1,2,10-12. No entanto, uma vez que a quantidade total de proteínas Gag obtidos nestes lisados ​​de células não são elevadas, a marcação metabólica das proteínas com aminoácidos marcados radioactivamente é necessário para a sua detecção.

Dependendo do método para medir as interações Gag-lípidos, têm sido utilizados uma variedade de preparações de membrana. Cada um desses métodos tem seus pontos fortes e limitações. A maioria dos ensaios baseados-RMN requerem a utilização de lípidos com acilo curtocadeias que são solúveis em água (por exemplo, C4-C8-e PI (4,5) P ₂₎ ^6,8. Enquanto os métodos de RMN de teste de ligação de Gag aos lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento encontradas nas células estão a ser desenvolvidos, eles foram usados ​​apenas com MA com ácido mirístico ou nonmyristoylated, até agora, ^8,13. Em alternativa, os lipossomas preparados a partir de lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento nativos têm sido utilizados em métodos bioquímicos, tais como lipossomas ou flotação fluorescente talão lipossoma ensaios de ligação ^{2,3,10,14-16.} No entanto, os lipossomas utilizados nestes ensaios têm pequenos diâmetros, e, assim, as suas membranas têm curvaturas acentuadas e positivos. Em contraste, durante a fase inicial de montagem de partículas em células de VIH-1 infectados, Gag se liga ao PM, que é praticamente planar na escala de Gag, e, subsequentemente, induz curvatura negativa durante a floração. Portanto, as membranas de lipossomas com curvatura acentuada e positivo pode não ser bicamadas lipídicas ideais para estudar as interações da mordaça-lipídico. Quanto Flot lipossomaensaios ation, outra ressalva potencial é que a exposição de complexos Gag-lipídicas para gradiente de sacarose hipertônica durante a centrifugação pode afetar o resultado experimental. Para atenuar estas limitações e proporcionar um sistema experimental complementar, para ensaios de ligação a GAG de gigantes vesículas unilamelares (GUVs) têm sido desenvolvidos nos últimos anos. GUVs são vesículas única bicamada lipídica cujos diâmetros se estendem a várias dezenas de micrómetros. Assim, a curvatura destas membranas se assemelha a PM na escala de Gag. Além disso, devido ao seu grande tamanho, que permite a inspeção visual sob microscópios ópticos, ligação à membrana proteínas da mordaça de fluorescência marcados ou rotulados com essas vesículas após a mistura pode ser facilmente determinada sem tratamento posterior dos complexos Gag-lipídicas.

Nós aqui descrevemos um protocolo para estudar HIV-1 Gag membrana ligação usando GUVs obtidos a partir de um método eletroformação. Vários métodos, tais como a hidratação suave, hidratação assistida-gel, microfonerofluidic de jacto, e eletroformação ^17-22 têm sido usados ​​para obter GUVs. Para o protocolo aqui descrito, o método da eletroformação é utilizado principalmente devido à sua eficiência na formação GUVs lípidos com ácidos e a sua relativa facilidade de utilização, sem a necessidade de instalações dispendiosas. Uma vez que a visualização de Gag necessita de um repórter fluorescente, amarela proteína fluorescente (YFP) está geneticamente adicionado ao C-terminal de Gag (gag-YFP). Proteínas gag-YFP são obtidos por reacções de transcrição in vitro e tradução em lisados ​​de gérmen de trigo com base na tecnologia contínua de permuta de fluxo contínuo (CECF). Nesta tecnologia, tanto a remoção de produtos secundários inibidores das reacções e fornecimento de substratos de reacção e componentes de energia são alcançados de um mecanismo baseado em diálise. Para estas reacções, é usado um plasmídeo que codifica Gag-YFP sob o controlo de um promotor de T7. É de notar, como mostrado anteriormente, lisados ​​de gérmen de trigo apoiar miristoila�o sem componentes adicionais ²3,24. Usando este método, foi possível obter quantidades suficientes de comprimento completo miristoilada Gag-YFP para visualização de Gag em membranas GUV ^24. Aqui nós descrevemos o protocolo com a qual o HIV-1 Gag ligação a PI (4,5) P ₂ molecular contendo membranas GUV podem ser examinados sem processamento subsequente longa seguinte reacções de ligação e propor que este método complementa preexistente Gag-membrana ensaios de ligação e pode ser estendido para entender melhor o HIV-1 Gag-membrana vinculativo.

Protocol

Dia 1: Expressão de mordaça proteínas utilizando a transcrição in vitro-translation sistema baseado em Lysate germe de trigo 1. Preparação do HIV-1 Gag Remove todos os reagentes do kit comercial CECF de gérmen de trigo a partir de congeladores (lisados ​​de gérmen de trigo são armazenadas a -80 ° C; outros reagentes, a -20 ºC). Descongelar-los em gelo e misturar os componentes como apresentados na Tabela 1. <table border="1" fo:kee…

Representative Results

Usando o protocolo acima, preparamos GUVs compostos por POPC + + POPS Chol (razão molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composição foi escolhida para aproximadamente reflectir as concentrações de colesterol e de PS PM. Robusto e eficiente ligação de Gag foi observada somente quando o cérebro-PI (4,5) P 2 foi incluída na mistura POPC + POPS + Chol-PI cerebral (4,5) P 2 [razão molar (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1], neste exemplo) (Figura 4, …

Discussion

O ensaio de ligação GUV como descrito acima fornece uma boa alternativa em situações onde outros ensaios de interação proteína-lipídica têm as suas limitações. Este ensaio nos permite examinar as interações entre ácido mirístico Gag de corpo inteiro e lipídios ácidos com cadeias acilo de comprimento nativa no contexto bicamada lipídica e fazê-lo sem longas centrifugação flotação por meio de alta densidade gradientes de sacarose ou outro processamento pós-obrigatório de Gag-lipídico complexos. O…

Materials

Digital Multimeter	Meterman	30XR	A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.
Function Generator	Instek	GFG-8216A	A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient.
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO	CG-90IN
Incubator	Hoefer		Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient
Vacuum chamber	Nalgene
Thermomixer R	Eppendorf	21516-166
Syringe	Hamilton	80400	Gauge 22S, Syringe number 702
PDMS	Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning	Sylgard, 184
RTS 100 Wheat Germ CECF Kit	BiotechRabbit, Berlin, Germany	BR1401001
DiD	Life Technologies, Carlsbad, CA	D7757
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL	850457C
POPS	Avanti Polar Lipids	840034C
Cholesterol	Avanti Polar Lipids	700041P
Brain-PI(4,5)P2	Avanti Polar Lipids	840046X