Denne protokollen beskriver bruk av kombinerte nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) bildebehandling og mikro-computertomografi (microCT) for å visualisere cerebral tromboemboli. Denne teknikken tillater kvantifisering av trombe byrde og evolusjon. Den NIRF avbildningsteknikk visualiserer fluorescensmerkede trombe i utskåret hjernen, mens microCT teknikken visualiserer trombe inne levende dyr med gullnanopartikler.
Direkte trombusavbilding visualiserer rotårsak av tromboembolisk infarkt. Å være i stand til å bilde tromben tillater direkte langt bedre undersøkelse av slag enn å stole på indirekte målinger, og vil være en potent og robust vaskulær forskningsverktøy. Vi bruker en optisk avbildning tilnærming som etiketter tromber med en molekylær avbildning trombe markør – en Cy5.5 nær-infrarødt, fluorescent (NIRF) probe som er kovalent bundet til fibrin-tråder av tromben av fibrin-tverrbindings enzymatisk virkning av aktivert koagulasjonsfaktor XHIa under prosessen av blodpropp modning. En mikro-computertomografi (microCT) -basert tilnærmingen bruker trombe økende gullnanopartikler (AuNPs) funksjon å målrette den viktigste komponenten av blodpropp: fibrin. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for den kombinerte in vivo microCT og ex vivo avbildning av NIRF tromboemboli i en musemodell av emboliske slag. Vi viser at in vivo </ em> microCT og fibrin-målrettet glykol-kitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) kan brukes til å visualisere både in situ tromber og cerebral embolic tromber. Vi beskriver også bruken av in vivo microCT baserte direkte trombusavbilding til serielt overvåke den terapeutiske effekten av vevsplasminogenaktivator-mediert trombolyse. Etter siste bildebehandling økten, vi demonstrere ved ex vivo NIRF bildebehandling omfang og fordeling av rest tromboemboli i hjernen. Til slutt beskriver vi kvantitativ bildeanalyse av microCT og NIRF bildedata. Den kombinerte teknikk for direkte trombusavbilding tillater to uavhengige metoder for visualisering tromben som skal sammenlignes: arealet av trombe-relaterte fluorescerende signal på ex vivo avbildning NIRF lignet med volumet av hyperdense microCT tromber in vivo.
Én av 6 personer vil ha et slag på et tidspunkt i livet. Hjerneinfarkt er langt den vanligste slag type, og står for om lag 80 prosent av alle slagtilfeller. Fordi tromboemboli forårsake de fleste av disse iskemisk slag, er det en økende interesse i direkte trombusavbilding.
Det ble anslått at om lag 2 millioner hjerneceller dør i løpet av hvert minutt av midt cerebral arterie okklusjon 1, som fører til slagordet "Tid er Brain". Computertomografi (CT) undersøkelser kan gjøres raskt, og er allment tilgjengelig; på grunn av dette, CT forblir avbildning av valget for den innledende diagnose og behandling av hyperakutt hjerneinfarkt. CT er spesielt verdifull for å informere de kritiske tidlige beslutninger: administrere vevsplasminogenaktivator (tPA) for trombolyse og / eller triaging til endovaskulær blodpropp-henting 2. Nåværende CT-baserte trombusavbilding, kan imidlertid ikke serielt spore cerebral tromboemboli in vivo, fordi den bruker indirekte metoder for å demonstrere tromber: etter opasifikasjon av blodet pool av joderte kontrast, er tromber demonstrert som fylling av feil i skipene. Det er dosegrenser og risiko forbundet med gjentatt administrasjon av joderte kontrast, som utelukker gjentatte avbildning av tromber på denne måten.
Det er derfor et kritisk behov for en direkte avbildning metodikk for cerebral blodpropper hos slagpasienter, for å tillate raskere og bedre behandling beslutninger for å bli gjort. Vi foreslår å oppnå dette ved å øke verdien av CT, den tiden brukes frontlinjen avbildningsfunksjonalitet for slag, med bruk av en trombe søkende nanoparticular molekylær avbildning agent.
Vi har vist at bruk av denne agenten ved hjelp av mikro-computertomografi (microCT), en høy oppløsning ex vivo eller in vivo (små dyr) avbildning versjon av CT som tillater rask datainnsamling <sup> 3,4. Selv med relativt dårlig bløtvev kontrast tilgjengelig for små dyr microCT (mye verre enn tilgjengelig fra menneskelig størrelse skannere), bilde agent var i stand til å søke og markere tromber ved å gjøre dem hyperdense på CT, en "tett fartøy skilt 'forsterket av molekylære bildebehandling.
Utfyller CT teknikken, har vår gruppe tidligere utviklet en optisk direkte trombusavbilding teknikk med Cy5.5 nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) probe for å visualisere cerebral blodpropp byrde 5. Dette er en ex vivo teknikk på post mortem hjerner, men er svært følsom, og tjener til å bekrefte in vivo data i forsknings setting.
Å ha både CT og NIRF basert trombe søkende imaging teknikker tillater oss å sammenligne og kontrast disse teknikkene for å oppnå svært informative data om rollen til tromben og trombusavbilding i ferd med iskemisk hjerneslag utvikling.
Here, beskriver vi en detaljert protokoll av en kombinert teknikk for in vivo microCT og ex vivo avbildning NIRF til direkte å visualisere tromboemboli i en musemodell av emboliske slag. Disse enkle og robuste metoder er anvendelige for å fremme forståelsen av trombotiske sykdommer ved å muliggjøre den nøyaktige in vivo vurdering av tromben byrde / fordelings og karakterisering av dynamisk trombe utvikling i en rask og kvantitativ måte in vivo i løpet av terapi, etterfulgt av ex vivo data som tjener som en kontroll og referansestandard for bekreftelse av in vivo avbildning funn.
Vi demonstrerte bruk av to komplementære molekylære bildeteknikker for direkte trombusavbilding i eksperimentelle modeller av embolisk slag: fibrin målrettet gull nanopartikkel (fib-GC-AuNP) for in vivo microCT basert bildebehandling, og en FXIIIa målrettet optisk avbildning probe for ex vivo fluorescerende bildebehandling.
Etter intravenøs administrering av fib-GC-AuNPs, ble tromber synlig for CT som tette strukturer, på grunn av at partiklene blir innfanget i det tr…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Korea Healthcare Technology R & D Project, Helse- og velferd (HI12C1847, HI12C0066), Bio & Medical Technology Development Program (2010-0019862) og Global Research Lab (GRL) program (NRF-2015K1A1A2028228) av National Research Foundation, finansiert av den koreanske regjeringen.
Machines | |||
microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
Software | |||
NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
Devices/Instruments | |||
Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
Reagents | |||
meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
Gold nanoparticles | Synthesis | ||
C15 optical agent | Synthesis | ||
Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |