높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼
Summary
높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.
Abstract
지난 10 년간의 신호 전달 경로, 전사 조절 네트워크, 유전자 발현, 유전자 편집 및 유전자 침묵의 분석 종을 잘라내 모델 종에서부터 식물 원형질체의 사용 부활되고있다. 또한, 상당한 진전 식물 게놈 이러한 시스템의 사용에 더 많은 이익을 생성 한 원형질체로부터 식물의 재생에 만들어졌다. 이 작품에서, 프로토콜은 로봇 플랫폼을 사용하여 '밝은 노란색'2 (BY-2) 담배 현탁 배양에서 원형질체 분리 및 변환의 자동화를 위해 개발되었다. 변환 절차는 콜리 플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (35S)의 제어하에 오렌지색 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)을 사용하여 검증 하였다. 원형질체의 OFP 발현 표면 형광 현미경으로 확인 하였다. 분석은 propidiu을 사용하여 원형질체 생산 효율 방법을 포함m 요오드화. 마지막으로, 저가 식용 효소는 엄청난 비용 원형질체의 분리 및 분석을 자동화 높은 처리량에 실험실 등급 효소의 필요성을 우회 원형질체 분리 절차를 사용 하였다. 본 연구에서 개발 된 프로토콜에 기초하여, 변형에 원형질 분리의 전체 과정은 운영자의 입력없이, 4 시간 이내에 수행 될 수있다. 이 연구에서 개발 된 프로토콜은 BY-2 세포 배양과 검증 동안, 절차 및 방법은 작물의 게놈 연구의 가속을 활성화해야합니다 모든 식물 현탁 배양 / 원형질체 시스템에 번역해야합니다.
Introduction
최근, 초식 동물 6 방지 매스 수율 7 증가하고 세포벽 들음 감소 가뭄 3,4- 내염성 5 부여 제초제 저항성 2 부여 각종 질병 한 극복 유전자 변형 작물의 설계에 배치 상당한 자극이 있었다 8. 이러한 경향은 dsRNA를 10, 11의 miRNA와 siRNA를 12까지 침묵 CRISPR TALENs과 9를 사용하여 게놈 편집 및 유전자를 포함한 형질 전환 식물을 생성하는 새로운 분자 도구의 개발에 힘 입어되었다. 이들 기술은 형질 전환 체의 생성을 단순화되었지만, 또한 트랜스 제닉 식물의 투명 수 식물 재생에 의존하는 기존의 시스템을 이용하여 스크리닝 될 수 생성 병목을 만들었다. 상기의 많은 침묵과 게놈 구조 편집 빠르게 식물에 삽입 될 수 있지만, 이러한 병목 관련타겟 특성 식물을 온실에서 분석 할 때까지 종종 발견되지 않는 목적하는 효과를 생산하지 못한다. 본 논문에서는 특히 표적 유전자 사일런 편집 및 유전자의 다수의 초기 스크리닝에서의 전류 병목 현상을 해결하기 위해, 식물 원형질체의 신속한 자동화 고 처리량 스크리닝하기위한 방법을 개발 하였다.
그대로 식물 세포 반대로 원형질체의 사용은 자동화 된 플랫폼의 개발을위한 여러 가지 장점을 갖는다. 먼저, 원형질체는 식물 세포벽의 분해 후에 격리되고, 더 이상 존재하지 않는 장벽이, 변환 효율은 13 커진다. 그대로 식물 세포 (14) 및 아그로 박테 리움 – 매개 형질 전환 15 바이오리 스틱스 (biolistics) 변환을위한 두 개의 잘 확립 된 방법이있다. 바이오리 스틱스 (biolistics)는 변압기의 용 전문 장비를 필요로 이러한 방법 중 어느 것도 쉽게, 액체 처리 플랫폼으로 변환 할 수 있습니다rmation, 아그로 박테 리움 반면 – 매개 변환은 공동의 문화와 박테리아의 연속적인 제거가 필요합니다. 둘 다 높은 처리량 방법에 대한 의무가 없습니다. 원형질체의 경우, 변환은 통상적으로 단지 몇 액 교환이 필요하며, 이상적으로는 액체 처리 플랫폼에 적합 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) – 매개 형질 감염 (16)를 사용하여 수행된다. 둘째, 원형질체는 정의에 의해 단일 세포 배양, 따라서 식물 세포 배양에서 응집 및 체인의 형성과 관련된 문제들, 원형질체에서 관찰되지 않는다. 접시 기반 분광 광도계, 세포의 응집을 사용하여 빠른 심사의 관점에서, 또는 여러면에서 세포는 일관된 측정을 획득 어려움으로 이어질 것입니다. 원형질체가 배지보다 또한 치밀하기 때문에, 이들은 플레이트 기반 측정법위한 도움이되는 단일 층을 형성하고, 웰의 바닥에 침전. 마지막으로, 식물 세포의 현탁 배양은 PRIMAR 반면ILY 캘러스 (17)로부터 유래 된 원형질체는 조직 – 특이 적 발현을 확인 할 수있는 능력에 이르는, 식물 조직의 개수에서 수확 될 수있다. 예를 들어, 기능 표현형 예측에 매우 중요 할 수 루트 레벨 또는 유전자의 잎 특이 적 발현을 분석한다. 이러한 이유로,이 연구에서 개발 된 프로토콜은 널리 사용되는 담배 (담배 속 tabacum L.) '밝은 노란색'2 (BY-2) 현탁 배양에서 분리 된 원형질체를 사용하여 검증 하였다.
에 의해-2 현탁 배양은 식물 세포 (18)의 분자 분석에서의 유비쿼터스 사용하기 때문에, 고등 식물의 "헬라"셀로 설명되었다. 최근 BY-2 세포는 식물의 효과를 연구하는 데 사용 된 세포 내 단백질 지역화 23, 24, 및 식물 생물학에서 이러한 문화의 다양한 유틸리티를 보여주는 기본적인 세포 생물학 25-27, 19-22을 스트레스. BY-2 문화의 또 다른 장점입니다유전자 발현에 대한 향상된 재현성을 초래할 수있는 aphidicolin와 문화를 동기화 할 수있는 능력은 28 연구. 또한, 방법은 전통적 원형질체를 생성하는데 사용 효소 선정 높은 스루풋 시스템 금지이기 때문에, 저비용 29,30 효소를 사용하여 -2- 원형질체의 추출을 위해 개발되었다. 이와 같이, 후술하는 프로토콜 BY-2 현탁 배양을 이용하여 검증되었지만, 어떤 식물 세포의 현탁 배양으로 수정할 수있는 있어야한다. 개념 증명 실험은 하드 산호 Porites에서 오렌지 형광 단백질 (OFP) 리포터 유전자 (pporRFP)는는 CaMV 35S 프로모터의 제어하에 31 porites 사용하여 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 프로토콜은 성공적으로 원형질체 분리, 열거, 및 변환에 의해-2 담배 현탁 세포 배양을 사용하기위한 검증되었습니다; 그러나, 프로토콜은 쉽게 식물 현탁 배양으로 확장 될 수있다. 현재, 원형질체 분리 및 변형 옥수수 (ZEA 메이스) (10), 당근 (Daucus의 carota) (32), 포플러 (사시 나무속 euphratica) (33), 포도 (유럽 종 포도) (34), 기…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by Advanced Research Projects Agency – Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
Materials
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4 dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly (ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
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