Rapid Molecular Detection og Differensiering av influensavirus A og B

Summary

Vi beskriver en hurtig, molekylær-baserte Influensa A og B assay. Den Influensa analysen registrerer hvert mål innen 15 min ved å ansette isotermisk forsterkning med influensaspesifikke primere etterfulgt av mål deteksjon med molekylære beacon sonder. Den Influensa A og B-analysen er brukervennlig og krevde minimal hands-on tid til å utføre.

Abstract

Influensa er en smittsom luftveissykdom forårsaket av influensavirus A og B hos mennesker og forårsaker en betydelig mengde av sykelighet og dødelighet hvert år. Den Influensa A og B-analysen var den første CLIA-fravikes molekylær rask influensa test tilgjengelig. Den Influensa A og B-test fungerer ved å ansette isotermisk forsterkning med influensaspesifikke primere etterfulgt av mål deteksjon med molekylære beacon sonder. Her utførelsen av influensa A og B-analyse på frossen, arkivert nasofaryngeal pinne (NPS) eksemplarer lagret i virustransportmedium (VTM) ble sammenlignet med en luftveis analysen panel.

Utførelsen av influensa A og B assay ble evaluert ved å sammenligne resultatene for luft panel referansemetoden. Følsomheten for total influensavirus A var 67,5% (95% KI (CI), 56,6 til 78,5) og spesifisiteten var 86,9% (CI, 71,0 til 100). For influensavirus B-testing, sensitivitet og spesifisitet var 90,2% (CI, 68,5 til 100) Og 98,8% (CI, 68,5 til 100), henholdsvis.

Dette systemet har fordelen av en vesentlig kortere tid enn test enhver annen for tiden tilgjengelig molekylær analyse og den enkle, pipette-fri fremgangsmåte kjører på en fullt integrert, lukket, liten plass system. Totalt sett er influensa A og B assay undersøkt i denne undersøkelsen har potensiale til å tjene som et point-of-care hurtig influensa diagnostisk test.

Introduction

Influensa virus infeksjoner resultere i en betydelig mengde av sykelighet og dødelighet hvert år ^{1, 2, 3.} Ukomplisert influensa er preget av konstitusjonelle og luftveissymptomer som feber, myalgi, hodepine, og ikke-produktiv hoste ^{4, 5.} Eldre personer, små barn, immunsupprimerte pasienter og pasienter med underliggende komorbiditet er på et høyere risiko for alvorlige komplikasjoner som lungebetennelse, myokarditt, sentralnervesystemet sykdom eller død ^{seks, syv.}

Influensainfeksjon er unik fra andre luftveisvirus i at rask behandling med antiviral behandling innen 48 timer fra symptomdebut kan redusere sykdommens alvorlighetsgrad og lengde ^8. Rask identifisering av influensa har også værtvist seg å redusere bruken av unødvendige antibiotika ^{9, 10.} Videre må innlagte pasienter med influensa infeksjoner plasseres i isolert rom med passende smittevern forholdsregler. Imidlertid kan luftveissykdommer forårsaket av ikke-influensavirus være vanskelig å skille fra klinisk influensa. Av denne grunn er hurtig og nøyaktig diagnostisk testing for influensa meget viktig for klinisk behandling av pasienten.

Flere analyser er tilgjengelige for påvisning og identifisering av influensavirus. Rapid influensa antigendeteksjon tester (RIDTs) er mye brukt i klinisk praksis som point-of-care testene fordi de er enkle å bruke og gir resultater innen 15 til 30 min ^{11, 12;} Men deres følsomhet varierer mye (10-80%), avhengig av produsent og befolkningen blir testet, og influensa type og subtype ^{13, 14, 15.} Direkte fluorescensanalyser (DFAs) gir overlegen følsomhet enn RIDTs, men behandlingstiden er større (~ 3 timer) og må fullføres av dyktige teknologer ^{16, 17.} Viral kultur har vært gullstandarden for influensadiagnose og har forbedret følsomhet over begge RIDTs og DFAs ^18. Imidlertid kan influensa viral kultur ta alt 2-14 d å fullføre, avtagende sin nytteverdi i å hjelpe pasientbehandling ^19. Endelig har nukleinsyreamplifikasjonsmetoder tester (NAAT) erstattet kultur teknikker som den nye gullstandarden i influensadiagnostikk. NAAT anses å ha størst følsomhet for påvisning av influensa i et par timer. Men NAAT er de dyreste analyser og krever spesialutstyr og teknologer for å utføre ⁵ <sopp>, ^{20, 21, 22, 23, 24, 25.}

Influensa A og B analyse beskrevet her er den første CLIA-fravikes molekyl hurtig influensa test som er lett tilgjengelig. Denne analysen fungerer ved å ansette en knekk Endonuklease Amplification Reaction (NEAR) som bruker isotermisk forsterkning med influensaspesifikke primere etterfulgt av mål deteksjon med molekylære beacon sonder. Denne analyse skiller influensa A fra B, krever 2 min for å sette opp og behandle en prøve, og krever totalt 15 minutter å fullføre.

Her presenterer vi protokollen for Influensa A & B-analysen. I tillegg gir vi en prøve datasett sammenligne resultatene av influensa A og B-analyse på arkiverte nasofaryngeal pinne (NPS) eksemplarer lagret i virustransportmedium (VTM) til et annet luft assay patogen panel.

Protocol

ETIKK UTTALELSE: Bruken av venstre-over kliniske prøver er godkjent og følger retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board. 1. Før Kjøre analysen MERK: Influensa A og B-analysen er godkjent for nasofaryngeale penselprøver og for nasofaryngeale kompresser som er lagret i virustransportmedium. Vattpinner er inkludert i settet og bør brukes for optimal ytelse. Imidlertid, rayon, skum, strømmet spinner eller polyester neseutstryk kan også brukes til å samle inn…

Representative Results

I denne studien ble arkivert NPS prøver samlet inn fra inneliggende pasienter presenterer med influensalignende symptomer på Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) under en influensa utbrudd mellom 15 desember 2012 og 1. mars 2013. NPS prøvene ble sendt inn i 3 ml av VTM og testet som del av rutinemessig klinisk praksis med et molekylært assay som oppdager et panel av respiratoriske virus (RP), inkludert Influensa A, A-1, A-3, og B. i løpet av studieperioden ble 3,675 NPS pr…

Discussion

Influensavirus er betydelige globale årsaker til sykelighet og dødelighet. Rask og nøyaktig diagnose av influensa er en av de viktigste nøklene til styring av influensa respiratorisk utbrudd i løpet av sesongen. Andre antigen-baserte tester er rask og enkel å utføre; men de har lav følsomhet ^13. På den annen side har tradisjonelle molekylære tester forbedret følsomhet, men krever mer erfarne laboratorie teknologer å utføre, og er mer kostbare. Den Influensa A og B analysen beskrevet …

Materials

Alere i Instrument	Alere	NAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit	Alere	425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode Scanner	Alere	EQ001001
Alere Universal Printer	Alere	55115 (Global), alereiprinter (US)
200 µL precision pipette
200 µL disposable pipette tips
Viral transport medium	Remel	M4-RT