हस्तक्षेप से मुक्त माइक्रो / Nanoparticle सेल इंजीनियरिंग के लिए microfluidic बफर एक्सचेंज
Summary
इस प्रोटोकॉल एक जड़त्वीय microfluidics आधारित बफर विनिमय रणनीति के उपयोग का वर्णन अपार कणों की कुशल कमी के साथ सूक्ष्म / nanoparticle इंजीनियर कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए।
Abstract
सक्रिय घटक से भरी हुई सूक्ष्म / नैनोकणों के साथ इंजीनियरिंग कोशिकाओं (एनपीएस), देशी चिकित्सीय गुणों को बढ़ाने के लिए जैव इमेजिंग सक्षम और सेल phenotype नियंत्रित करने के लिए एक तेजी से लोकप्रिय तरीका बनता जा रहा है। एक महत्वपूर्ण अभी तक अपर्याप्त संबोधित मुद्दा कणों कि सेल लेबलिंग जो आसानी से पारंपरिक centrifugation द्वारा नहीं हटाया जा सकता है के बाद अपार रहने के महत्वपूर्ण संख्या है। यह जैव इमेजिंग पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि हो जाती है और पड़ोसी गैर लक्ष्य कोशिकाओं पर परिवर्तनकारी प्रभाव प्रदान कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक जड़त्वीय microfluidics आधारित बफर विनिमय रणनीति डीन प्रवाह Fractionation (डीएफएफ) के रूप में कहा कुशलता से एक उच्च throughput ढंग से मुक्त एनपीएस से लेबल की कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपस्थित थे। विकसित सर्पिल microdevice, शुद्ध कोशिकाओं (THP-1 और MSCs) नई बफर समाधान में निलंबित की सतत संग्रह (> 90% सेल वसूली) की सुविधा है, जबकि अपार फ्लोरोसेंट रंजक या डाई-लोडेड एनपीएस (एसआईएल के> 95% की कमी को प्राप्त करनेआईसीए या पीएलजीए)। यह एकल कदम, आकार के आधार पर सेल शुद्धि रणनीति उच्च सेल प्रसंस्करण throughput (10 6 कोशिकाओं / मिनट) सक्षम बनाता है और सूक्ष्म / nanoparticle इंजीनियर कोशिकाओं की बड़ी मात्रा सेल शुद्धि हस्तक्षेप से मुक्त नैदानिक आवेदन प्राप्त करने के लिए अत्यधिक उपयोगी है।
Introduction
एजेंट से भरी हुई सूक्ष्म / नैनोकणों (एनपीएस) द्वारा कोशिकाओं इंजीनियरिंग bioimaging क्षमता बढ़ाने के लिए और बढ़ाने / पुनर्योजी चिकित्सा में इसके मूल चिकित्सीय गुणों के पूरक के लिए एक सरल, जीनोमिक एकीकरण से मुक्त, और बहुमुखी विधि है। 1-3 सेलुलर संशोधनों लेबल करके प्राप्त कर रहे हैं प्लाज्मा झिल्ली या एजेंट से भरी हुई एनपीएस की एक अतिरिक्त एकाग्रता के साथ कोशिका द्रव्य बाध्यकारी साइटों तर करने के लिए। हालांकि, इस पद्धति की एक बड़ी खामी परिवर्तनकारी युक्त एनपीएस में अपार सेल लेबलिंग प्रक्रियाओं के बाद समाधान में शेष कणों की मात्रा महत्वपूर्ण है, जो संभवतः कण-इंजीनियर कोशिकाओं की सटीक पहचान उलझाना या चिकित्सीय परिणामों को मुश्किल। 4,5 इसके अलावा कर सकते हैं, जोखिम है एजेंट (वृद्धि कारक है, corticosteroids, आदि) के लिए जरूरत से ज्यादा उच्च एकाग्रता में cytotoxicity और misdirected जोखिम का कारण गैर लक्ष्य कोशिकाओं पर अनपेक्षित परिणाम उत्पन्न हो सकता है कर सकते हैं। यहाँ तक कि कण ओ जिसमें वाहकएफ "biocompatible" सामग्री [जैसे, पाली (लैक्टिक सह एसिड), पीएलजीए] कुछ शर्तों के तहत शक्तिशाली प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से उत्तेजित कर सकते हैं। 6 यह बिगड़ा प्रतिरोधक क्षमता (जैसे, रुमेटी गठिया) जो संभावित देरी के साथ व्यक्तियों में विशेष रूप से जोखिम भरा है प्रणालीगत nanoparticle निकासी। 7 इस प्रकार, पूर्व कण-इंजीनियर कोशिकाओं की शुरूआत करने के लिए स्वतंत्र कणों के कुशल हटाने विषाक्तता प्रोफ़ाइल को कम करने और इन विवो में एजेंट से भरी हुई कणों को गलत दिशा में जोखिम कम करने के लिए बहुत महत्व का है।
परम्परागत ढाल centrifugation अक्सर मुक्त कणों से इंजीनियर कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन श्रमसाध्य है और बैच मोड में संचालित है। इसके अलावा, कतरनी तनाव उच्च गति centrifugation के दौरान कोशिकाओं और घनत्व ढाल मध्यम सेल अखंडता और / या प्रभाव सेल व्यवहार समझौता हो सकता है के घटकों द्वारा अनुभव किया। 8 Microfluidics सेव के साथ एक आकर्षक विकल्प हैनियतात्मक पार्श्व विस्थापन (DLD) 9, 10,11 और 12 dieletrophoresis छोटे कणों जुदाई और बफर विनिमय अनुप्रयोगों के लिए विकसित acoustophoresis सहित आम जुदाई प्रौद्योगिकियों। हालांकि, इन तरीकों कम throughput से ग्रस्त (1-10 μl · मिनट – 1) और मुद्दों clogging से ग्रस्त हैं। ऐसे dielectrophoresis आधारित विधियों के रूप में चर्चित विभाजन भी आंतरिक dielectrophoretic सेल phenotypes या जुदाई को प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त सेल लेबलिंग चरणों में मतभेद की आवश्यकता होती है। भर कणों या कोशिकाओं के पार्श्व प्रवास इसकी उच्च प्रवाह की स्थिति और बेहतर आकार संकल्प के कारण उच्च रेनॉल्ड्स संख्या (रे) 13 पर प्रमुख लिफ्ट बलों (एफ एल) के कारण अलग-अलग पदों पर ध्यान केंद्रित करने की सुव्यवस्थित – एक और अधिक आशाजनक दृष्टिकोण जड़त्वीय microfluidics शामिल है। , यह अक्सर 16-18 आकार के आधार पर सेल जुदाई 14,15 और बफर विनिमय अनुप्रयोगों के लिए शोषण किया गया है। Howeveआर, बफर विनिमय प्रदर्शन ~10-30% दूषित पदार्थों को समाधान के साथ गरीब बना रहता है के रूप में अलग कोशिकाओं को आमतौर पर मूल और नए बफर समाधान के बीच सीमा के करीब रहते हैं। 16-18 इससे भी महत्वपूर्ण बात, लक्ष्य कोशिकाओं के आकार के वितरण के लक्ष्य को हासिल करने के लिए समान हो गया है सटीक जड़त्वीय ध्यान केंद्रित है और मूल बफर समाधान है जो विशेष रूप से (MSCs) ऐसे mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के रूप में विषम आकार प्रकार की कोशिकाओं के प्रसंस्करण में एक मुद्दा बन गया है से जुदाई। 19
हम पहले से विकसित किया है एक नया जड़त्वीय microfluidics सेल छँटाई तकनीक एक 2-इनलेट, 2-आउटलेट सर्पिल microchannel डिवाइस का उपयोग कर घूम ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) 20 और बैक्टीरिया 21 पूरे रक्त से अलग-थलग करने के लिए डीन प्रवाह Fractionation (डीएफएफ) करार दिया। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम लेबलिंग THP-1 (मानव तीव्र monocytic ल्यूकेमिया सेल लाइन) निलंबन monocytic कोशिकाओं (~ 15 माइक्रोन) और calcein-एल के साथ MSCs (10-30 माइक्रोन) की प्रक्रिया का वर्णन करेंगेoaded एनपीएस, निर्माण और लेबल की कोशिकाओं और अपार एनपीएस के हटाने के कुशल वसूली के लिए डीएफएफ सर्पिल microdevice के आपरेशन के द्वारा पीछा किया। 22 यह भी कदम शुद्धि रणनीति लेबल निलंबन और centrifugation बिना ताजा बफर समाधान में निलंबित कर दिया पक्षपाती कोशिकाओं की निरंतर वसूली सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह 10 मिलियन कोशिकाओं · मिलीलीटर -1, एक सेल घनत्व पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी तक की प्रक्रिया कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
डीएफएफ सेल शोधन तकनीक के साथ साथ वर्णित एक उच्च throughput तरीके से लेबल कोशिकाओं का तेजी से और निरंतर जुदाई में सक्षम बनाता है। इस जुदाई दृष्टिकोण बड़ा नमूना मात्रा या उच्च सेल एकाग्रता नमूना प्रसंस्करण के …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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