ميكروفلويديك تبادل العازلة لمايكرو / الجسيمات النانوية هندسة الخلايا خالية من التدخل
Summary
يصف هذا البروتوكول استخدام استراتيجية الصرف عازلة القائم على microfluidics بالقصور الذاتي لتنقية الصغير / جسيمات متناهية الصغر خلايا هندسيا مع نضوب الفعال للجزيئات غير منضم.
Abstract
خلايا الهندسة مع الصغير تحميل النشط العنصر / النانوية (NPS) أصبحت وسيلة شعبية متزايدة لتعزيز الخصائص العلاجية الأم، تمكين التصوير الحيوية والسيطرة على النمط الظاهري الخلية. ثمة مسألة حاسمة بعد تلقى العناية الكافية لعدد كبير من الجسيمات التي لا تزال غير منضم بعد خلية وضع العلامات التي لا يمكن إزالتها بسهولة عن طريق الطرد المركزي التقليدي. وهذا يؤدي إلى زيادة في الضوضاء الخلفية التصوير الحيوي، ويمكن نقلها آثار تحول إلى خلايا غير المستهدفة المجاورة. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم استراتيجية بالقصور الذاتي القائم على microfluidics عازلة الصرف توصف بأنها دين تدفق التقطير (الأمر الواقع) للفصل بين كفاءة الخلايا المسمى من مصادر القدرة النووية حرة بطريقة إنتاجية عالية. وmicrodevice دوامة المتقدمة يسهل جمع المستمر (> الانتعاش خلية 90٪) من الخلايا تنقيته (THP-1 واللجان الدائمة) معلقة في حل العازلة الجديد، في حين تحقيق نضوب> 95٪ من صبغة الفلورسنت غير منضم أو مصادر القدرة النووية صبغ تحميل (سيلالحلف أو PLGA). هذه خطوة واحدة، تمكن استراتيجية تنقية الخلايا القائم على حجم الخلية عالية التجهيز الإنتاجية (10 6 خلية / دقيقة)، ومفيدة للغاية لتنقية الخلايا حجم كبير من جسيمات متناهية الصغر هندسيا خلايا / الدقيقة لتحقيق التطبيق السريري مجانا للتدخل.
Introduction
هندسة الخلايا الصغيرة / النانوية محملة كيل (NPS) هو بسيط الجيني خالية من التكامل، وتنوعا طريقة، لتعزيز قدرة bioimaging وزيادة / تكملة خصائصه العلاجية المحلية في مجال الطب التجديدي. وتتحقق 1-3 التعديلات الخلوية التي كتبها وصفها غشاء البلازما أو الهيولى مع التركيز الزائد من مصادر القدرة النووية محملة كيل لتشبع مواقع الربط. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو كميات كبيرة من الجزيئات غير منضم المتبقية في حل بعد عمليات الخلية وضع العلامات، والتي من المحتمل أن نخلط التحديد الدقيق للخلايا المهندسة الجسيمات أو تعقيد النتائج العلاجية. 4،5 وبالإضافة إلى ذلك، والتعرض لمصادر القدرة النووية التي تحتوي التحويلية وكلاء (عوامل النمو، القشرية، وما إلى ذلك) في تركيز عال بشكل مفرط يمكن أن يسبب السمية الخلوية والتعرض المهدورة ربما تتسبب في عواقب غير مقصودة على الخلايا غير المستهدفة. حتى لشركات الطيران الجسيمية التي تضم سو المواد "حيويا" [على سبيل المثال، بولي (اللبنيك المشترك حمض الجليكوليك)، PLGA] يمكن أن تحرض على استجابات الخلايا المناعية فعالة في ظل ظروف معينة أيضا. 6 وهذا أمر محفوف بالمخاطر وخاصة في الأشخاص الذين يعانون ضعف المناعة (مثل التهاب المفاصل الروماتويدي) التي يحتمل التأخير النظامية إزالة جسيمات متناهية الصغر. 7 وهكذا، وإزالة فعالة من جزيئات حرة قبل إدخال الخلايا المهندسة الجسيمات ذات أهمية كبيرة لتقليل سميته والحد من التعرض للاساءة الى جزيئات محملة عامل في الجسم الحي.
وكثيرا ما يستخدم التقليدي التدرج الطرد المركزي لفصل خلايا هندستها من جزيئات حرة ولكن شاقة وتشغيلها في دفعة واسطة. وعلاوة على ذلك، اجهادات القص التي تمر بها الخلايا أثناء عالية السرعة الطرد المركزي ومقومات المتوسطة الكثافة التدرج قد تعرض سلامة الخلية و / أو سلوك الخلية النفوذ. 8 على microfluidics هو بديلا جذابا مع بغازيتكنولوجيات الفصل األطراف بما في ذلك النزوح الأفقي القطعية (DLD) 9، dieletrophoresis 10،11 وacoustophoresis 12 ضعت لفصل جزيئات صغيرة والتطبيقات الصرف العازلة. ومع ذلك، هذه الأساليب تعاني من سرعة منخفضة (1-10 ميكرولتر · دقيقة – 1) وتكون عرضة للانسداد القضايا. تتطلب فصل النشطة مثل أساليب تعتمد على dielectrophoresis أيضا اختلافات في الظواهر خلية dielectrophoretic الجوهرية أو خطوات إضافية خلية وضع العلامات لتحقيق الانفصال. ويشمل اتباع نهج أكثر واعدة على microfluidics بالقصور الذاتي – الهجرة الجانبية للجزيئات أو خلايا عبر يبسط إلى التركيز على مواقع متميزة نظرا لقوات رفع المهيمنة (F L) في ارتفاع عدد رينولدز (إعادة) 13 نظرا لظروف تدفق عالية، وقرار حجم متفوقة. وكثيرا ما تم استغلاله لتطبيقات الصرف على أساس حجم فصل الخلية 14،15 والعازلة. 16-18 Howeveص، يبقى أداء البورصة عازلة الفقراء مع حل الملوثات ~10-30٪ كما تبقى عادة الخلايا فصل على مقربة من الحدود بين الحلول الأصلية وعازلة جديد 16-18 الأهم من ذلك أن توزيع حجم الخلايا المستهدفة أن تكون مماثلة لتحقيق بالقصور الذاتي الدقيق التركيز والانفصال عن حل العازلة الأصلي الذي يطرح قضية لا سيما في معالجة أنواع غير متجانسة الحجم الخلايا مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة). 19
لقد سبق وضعها تقنية جديدة خلية على microfluidics بالقصور الذاتي الفرز ووصف عميد تدفق التقطير (الأمر الواقع) لعزل تعميم الخلايا السرطانية (CTCs) 20 والبكتيريا 21 من الدم الكامل باستخدام 2-مدخل، 2-منفذ جهاز متناهية دوامة. في هذا البروتوكول الفيديو، فإننا سوف وصف عملية وضع العلامات THP-1 الخلايا (الإنسان حاد خط خلية سرطان الدم الوحيدات) تعليق حيدي (~ 15 ميكرون)، واللجان الدائمة (10-30 ميكرون) مع calcein-Loaded مصادر القدرة النووية، يليه تصنيع وتشغيل microdevice دوامة قوات الأمر الواقع لاستعادة كفاءة من الخلايا المسمى وإزالة تلك المصادر غير منضم. تمكن 22 هذه الاستراتيجية تنقية خطوة واحدة الانتعاش المستمر للتعليق وصفت والخلايا الملتصقة مع وقف التنفيذ في حل العازلة جديدة دون الطرد المركزي. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن معالجة ما يصل إلى 10 مليون خلية · مل -1، وكثافة الخلايا قابلة للتطبيقات الطب التجديدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
التكنولوجيا قوات الأمر الواقع تنقية الخلايا الموصوفة هنا تمكن فصل سريع ومتواصل من الخلايا المسمى بطريقة إنتاجية عالية. هذا النهج فصل مثالية لحجم العينة كبير أو ارتفاع تركيز خلية تجهيز العينات، وأفضل من الترشيح التي تعتمد على الأغشية التقليدية التي هي عرضة للانسداد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
