Mikrofluid Buffer Exchange til Interferensfri Micro / Nanopartikel Cell Engineering
Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af et inertial mikrofluidik-baserede bufferskift strategi til oprensning mikro / nanopartikel manipulerede celler med effektiv udtømning af ubundne partikler.
Abstract
Engineering celler med aktiv-ingrediens-loaded mikro- / nanopartikler (NPS) bliver en stadig mere populær metode til at forbedre indfødte terapeutiske egenskaber, aktivere bio imaging og styre celle fænotype. En kritisk endnu utilstrækkeligt behandlet problem er det store antal partikler, der forbliver ubundet efter cellemærkning, som ikke let kan fjernes ved konventionel centrifugering. Dette fører til en stigning i bio imaging baggrundsstøj og kan give transformative virkninger onto nabolande uden for målgruppen celler. I denne protokol, præsenterer vi en inerti mikrofluidik-baserede buffer udveksling strategi betegnes som Dean Flow Fraktionering (DFF) til effektivt at separere mærkede celler fra frie nationale parlamenter på en high throughput måde. Den udviklede spiral microdevice letter kontinuerlig samling (> 90% celleindvinding) renset celler (THP-1 og MSC) suspenderet i ny bufferopløsning, og samtidig opfylde> 95% depletering af ubundet fluorescerende farvestof eller Dye-loaded NP'er (silICA eller PLGA). Denne enkelt trin, størrelse-baserede celle rensning strategi giver høj celle behandling gennemløb (10 6 celler / min) og er yderst nyttigt for store mængder celle rensning af mikro- / nanopartikel manipuleret celler for at opnå fejlfri klinisk anvendelse.
Introduction
Engineering celler ved agent-loaded mikro- / nanopartikler (NPS) er en enkel, genomisk integration-fri, og alsidig metode til at forbedre bioimaging kapacitet og forøge / supplere sine indfødte terapeutiske egenskaber i regenerativ medicin. 1-3 Cellular modifikationer opnås ved mærkning af plasmamembranen eller cytoplasmaet med et overskud koncentrationen af midlet-loaded NP'er at mætte bindingsstederne. Men en stor ulempe ved denne metode er de betydelige mængder af ubundne partikler tilbage i opløsning efter mærkning celle processer, som potentielt kan forvirre præcis identifikation af partikel-celler eller komplicere terapeutiske resultater. 4,5 Desuden, eksponering for nationale parlamenter, der indeholder transformative midler (vækstfaktorer, kortikosteroider, etc.) ved for høj koncentration kan forårsage cytotoksicitet og fejlrettet eksponering kan fremkalde utilsigtede konsekvenser på ikke-målceller. Selv partikelformige bærere, der omfatter of "biokompatible" materialer [f.eks, poly (mælkesyre co-glycolsyre), PLGA] kan opildne potente immun celle responser visse betingelser samt. 6 Dette er især risikabelt hos personer med svækket immunitet (fx leddegigt) som potentielt forsinkelser systemisk nanopartikel clearance. 7 således effektiv fjernelse af frie partikler forud for indførelsen af partikel-modificerede celler er af stor betydning at minimere toksicitetsprofil og reducere fejldirigeret eksponering for agent-loaded partikler in vivo.
Konventionel gradientcentrifugering anvendes ofte til at adskille manipulerede celler fra frie partikler, men er besværlig og drives i batch-mode. Desuden forskydningsspændinger opleves af celler under høj hastighed centrifugering og bestanddele af densitetsgradient medium kan kompromittere celle integritet og / eller indflydelse celle adfærd. 8 Microfluidics er et attraktivt alternativ med sevrale teknologier separation herunder deterministisk sideforskydning (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 og akustoforese 12 udviklet til små partikler separation og bufferudskiftning applikationer. Imidlertid lider disse fremgangsmåder fra lille produktion (1-10 pi · min – 1) og er tilbøjelige til tilstopning problemer. Aktive separationer såsom dielektroforese-baserede metoder kræver også forskelle i iboende dielektroforetisk celle fænotyper eller yderligere skridt mærkning celle for at opnå separation. En mere lovende tilgang involverer inerti mikrofluidik – den laterale vandring af partikler eller celler på tværs strømliner at fokusere på forskellige positioner på grund af dominerende lift kræfter (F L) ved høje Reynolds tal (Re) 13 På grund af sin høje strømningsforhold og overlegen størrelse opløsning. det er ofte blevet udnyttet til størrelse-baserede celleseparation 14,15 og buffer udvekslingsprogrammer. 16-18 However, buffer udveksling ydeevne forbliver fattige med ~10-30% forurenende løsning, da de adskilte celler normalt forbliver tæt på grænsen mellem originale og nye bufferopløsninger. 16-18 Vigtigere, størrelsesfordelingen af target-celler skal være ens for at opnå præcis inertial fokusering og adskillelse fra den oprindelige pufferopløsning, der udgør et problem, især i behandlingen af heterogene størrelse celletyper såsom mesenkymale stamceller (MSC'er). 19
Vi har tidligere udviklet en ny inertial mikrofluidik cellesortering teknik betegnet Dean Flow Fraktionering (DFF) til isolering af cirkulerende tumorceller (CTCs) 20 og bakterier 21 fra fuldblod under anvendelse af en 2-indløb, 2-udløb spiral mikrokanal enhed. I denne video protokol, vil vi beskrive processen med mærkning THP-1 (human akut monocytisk leukæmi cellelinje) suspension monocytiske celler (~ 15 pm) og MSC'er (10-30 um) med calcein-loaded nationale parlamenter, efterfulgt af fremstilling og drift af DFF spiral microdevice for effektiv inddrivelse af mærkede celler og fjernelse af ubundne NP'er. 22 Denne enkelt trin rensning strategi muliggør kontinuerlig genvinding af mærket suspension og adhærente celler suspenderet i frisk bufferopløsning uden centrifugering. Det kan desuden behandle op til 10 millioner celler · ml-1, en celletæthed medgørlige til regenerativ medicin applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
DFF celle rensning teknologi beskrevet heri muliggør hurtig og kontinuerlig adskillelse af mærkede celler i et højt gennemløb måde. Denne adskillelse tilgang er ideel til store prøvevolumen eller høj koncentration celle prøve behandling, og er bedre end konventionel membran-baserede filtrering, som er tilbøjelige til at tilstopning efter længere tids brug. Tilsvarende affinitet-baserede magnetisk separation kræver yderligere trin mærkning celle, som er besværlig og dyr. De oprensede celler er vist at bevare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
