Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria
Summary
Questo protocollo descrive l'uso di una strategia di scambio tampone microfluidica basata inerziale per purificare cellule ingegnerizzate micro / nanoparticelle con efficiente esaurimento delle particelle non legate.
Abstract
cellule Engineering con micro-ingrediente attivo-caricato / nanoparticelle (NP) sta diventando un metodo sempre più popolare per migliorare le proprietà terapeutiche nativi, abilitare l'imaging bio e controllare il fenotipo delle cellule. Un problema critico ancora affrontato in modo inadeguato è il numero di particelle che rimangono non legato dopo l'etichettatura delle cellule che non può essere facilmente rimosso per centrifugazione convenzionale. Questo porta ad un aumento della bio rumore delle immagini di sfondo e può impartire effetti trasformativi sulle cellule non bersaglio adiacenti. In questo protocollo, presentiamo una strategia inerziale microfluidica a base di buffer di scambio definito come Dean flusso Frazionamento (DFF) per separare in modo efficiente cellule marcate da NP liberi in un modo elevato throughput. Il Microdevice spirale sviluppato facilita raccolta continua (> il recupero delle cellule del 90%) delle cellule purificate (THP-1 e MSC) sospese in nuova soluzione tampone, oltre a raggiungere> 95% esaurimento di colorante fluorescente non legato o NP dye-caricato (silica o PLGA). Questo single-step, la strategia di purificazione delle cellule size-based permette un throughput di elaborazione ad alta cella (10 6 cellule / min) ed è molto utile per la purificazione delle cellule di grandi volumi di micro / cellule nanoparticelle progettato per realizzare applicazioni cliniche senza interferenze.
Introduction
Ingegneria delle cellule da agenti caricato micro / nanoparticelle (NP) è un metodo di integrazione libera e versatile semplice, genomica per migliorare la capacità bioimmagini e aumentare / integrare le sue proprietà terapeutiche nativi nella medicina rigenerativa. 1-3 modificazioni cellulari si ottengono l'etichettatura del membrana plasmatica o nel citoplasma con un eccesso di concentrazione di NP agente-caricato di saturare i siti di legame. Tuttavia, un grave inconveniente di questo metodo è la quantità significative di particelle non legate rimangono in soluzione dopo i processi di etichettatura delle cellule, che possono potenzialmente confondere precisa identificazione delle cellule di particelle-ingegnerizzato o complicare risultati terapeutici. 4,5 Inoltre, l'esposizione a NP contenenti trasformativa agenti (fattori di crescita, corticosteroidi, ecc) a eccessivamente alta concentrazione possono causare citotossicità e l'esposizione mal possono indurre conseguenze non volute sulle cellule non bersaglio. Anche i portatori di particolato composto of materiali "biocompatibili" [per esempio, poli (co-glicolico acido lattico), PLGA] possono incitano potenti risposte delle cellule immunitarie in determinate condizioni pure. 6 Ciò è particolarmente rischiosa in individui con sistema immunitario compromesso (per esempio, l'artrite reumatoide) che potenzialmente ritardi sistemica pallone nanoparticella. 7 Pertanto, rimozione efficiente di particelle libere prima dell'introduzione delle cellule particelle-ingegnerizzato è di grande importanza per minimizzare profilo di tossicità e ridurre l'esposizione alle particelle misdirected agenti caricata in vivo.
Conventional centrifugazione gradiente è spesso usato per separare le cellule ingegnerizzate da particelle libere, ma è laboriosa e gestito in modalità batch. Inoltre, sforzi di taglio con esperienza da parte delle cellule durante la centrifugazione ad alta velocità ed i costituenti del mezzo gradiente di densità possono compromettere l'integrità delle cellule e / o il comportamento delle cellule influenza. 8 microfluidica è un'alternativa attraente con SEVtecnologie di separazione rale tra cui spostamento laterale deterministico (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 e acoustophoresis 12 sviluppata per le piccole particelle di separazione e le applicazioni di scambio di buffer. Tuttavia, questi metodi soffrono di bassa produttività (1-10 ml · min – 1) e sono soggetti a intasamento problemi. separazioni attivi quali i metodi dielettroforesi basati richiedono anche le differenze di fenotipi cellulari dielettroforetica intrinseche o aggiuntive misure di etichettatura delle cellule per realizzare la separazione. Un approccio più promettente coinvolge microfluidica inerziale – la migrazione laterale di particelle o cellule attraverso semplifica mettere a fuoco in posizioni distinte a causa di forze di sollevamento dominanti (F L) ad alto numero di Reynolds (Re) 13 Grazie alle sue condizioni di alta portata e la risoluzione dimensione superiore. , è stato spesso sfruttato per applicazioni di scambio di dimensioni basate su separazione delle cellule 14,15 e di buffer. 16-18 HoweveR, le prestazioni di Exchange tampone rimane povero con una soluzione di contaminante ~10-30% come le cellule separate di solito rimangono in prossimità del confine tra soluzioni originali e nuovo buffer. 16-18 Ancora più importante, la distribuzione delle dimensioni delle cellule bersaglio deve essere simile a raggiungere precisa inerziale focalizzazione e separazione dalla soluzione tampone originale che pone un problema particolare nel trattamento di tipi cellulari eterogenei dimensioni come le cellule staminali mesenchimali (MSC). 19
Abbiamo già messo a punto una nuova tecnica di smistamento delle cellule inerziale microfluidica chiamato Dean flusso Frazionamento (DFF) per isolare le cellule tumorali circolanti (CTC) 20 e batteri 21 dal sangue intero con un 2-ingresso, 2-outlet dispositivo microcanali spirale. In questo protocollo video, descriveremo il processo di cellule THP-1 di etichettatura (acuta linea cellulare monocitica leucemia umana) sospensione monociti (~ 15 micron) e MSC (10-30 micron) con calceina-lNP oaded, seguita da realizzazione e di funzionamento della spirale Microdevice DFF per recupero efficiente di cellule marcate e rimozione delle NP non legati. 22 Questa strategia unica purificazione passo consente il ripristino continuo della sospensione etichettati e cellule aderenti sospese in soluzione tampone fresco senza centrifugazione. Inoltre, si può elaborare fino a 10 milioni di cellule · ml -1, una densità cellulare suscettibili per applicazioni di medicina rigenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnologia di purificazione delle cellule DFF qui descritta consente la separazione rapida e continua di cellule marcate in maniera elevata produttività. Questo approccio separazione è ideale per grandi volumi campione o campione di trasformazione alta concentrazione cellulare, ed è meglio di filtrazione su membrana a base convenzionale che è soggetta a intasamento dopo un uso prolungato. Analogamente, separazione magnetica affinità basata richiede ulteriori operazioni di etichettatura cellule che sono laboriosi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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