干渉のないマイクロ/ナノ粒子の細胞工学のためのマイクロ流体緩衝液交換
Summary
このプロトコルは、非結合粒子を効率的に枯渇してマイクロ/ナノ粒子操作された細胞を精製するために、慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略の使用を記載しています。
Abstract
活性成分ロードマイクロ/ナノ粒子を有する細胞を操作する（NPS）は、ネイティブの治療特性を向上させるバイオイメージングを可能にし、細胞表現型を制御するために、ますます一般的な方法になってきています。クリティカルまだ不十分な対処の問題は容易に従来の遠心分離によって除去することができない細胞標識後に結合しないままの粒子のかなりの数です。これは、バイオイメージング、バックグラウンドノイズの増加をもたらし、隣接する非標的細胞に変革効果を付与することができます。このプロトコルでは、我々は効率的に高スループットの方法で遊離のNPから標識細胞を分離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ば慣性マイクロ流体ベースのバッファ交換戦略を提示します。未結合の蛍光色素又は染料装填のNP（SILの> 95％の枯渇を達成しながら開発スパイラルマイクロデバイスは、新たな緩衝液に懸濁精製細胞（THP-1およびMSC）の連続的な回収（> 90％の細胞回復）を容易にしますICAまたはPLGA）。このシングルステップ、サイズに基づく細胞の精製戦略は、高いセル処理能力（10 6細胞/分）を可能にし、干渉のない臨床応用を実現するために、マイクロ/ナノ粒子操作された細胞の大容量セルの精製に非常に有用です。
Introduction
エージェントにロードされたマイクロ/ナノ粒子（NPS）によって細胞を操作するには、バイオイメージング能力を高め、再生医療において、ネイティブの治療特性を補う/強化するために、単純な、ゲノム組込みフリーで、かつ汎用性の高い方法。1-3携帯修正は標識することによって達成されますエージェントにロードされたNPの過剰濃度の形質膜や細胞質は結合部位を飽和させます。しかし、この方法の主な欠点は、潜在的に、粒子操作された細胞の正確な同定を混乱させるまたは治療結果を複雑にすることができる細胞標識工程の後に溶液中に残存する未結合の粒子のかなりの量である。また4,5、変革を含むのNPへの曝露過度に高濃度の薬剤（成長因子、コルチコステロイド、 等）は、非標的細胞に意図しない結果を誘導し得る細胞毒性および誤った露出を引き起こす可能性があります。 Oを備えても粒子状キャリアF「生体適合性」材料[ 例えば 、ポリ（乳酸-co-グリコール酸）、PLGA]は同様に、一定の条件の下で強力な免疫細胞応答を扇動することができます。6これは、免疫障害（ 例えば 、関節リウマチ）、潜在的な遅延を有する個体において特に危険です全身ナノ粒子のクリアランス。7したがって、従来の粒子-操作された細胞の導入に自由粒子の効率的な除去は、毒性プロフィールを最小化し、in vivoでのエージェントにロードされた粒子に見当違いの露出を減らすために非常に重要です。
従来勾配遠心分離は、多くの場合、自由粒子から操作された細胞を分離するために使用されるが、面倒であり、バッチモードで操作されます。また、高速遠心分離中に細胞および細胞の完全性および/ または影響の細胞の挙動を損なう可能性密度勾配媒質の成分が経験するせん断応力は、8マイクロフルイディクスは、SEVで魅力的な代替手段であります決定論的横変位（DLD）9を含むERAL分離技術、10,11を dieletrophoresisと小さな粒子の分離およびバッファ交換用に開発12を acoustophoresis。しかしながら、これらの方法は、（分・1-10μL – 1）低いスループット苦しむとの問題を目詰まりを起こしやすいです。このような誘電泳動に基づく方法のような活性の分離はまた、分離を達成するために固有の誘電細胞表現型または追加の細胞標識手順の違いを必要とします。全体の粒子または細胞の横方向の移動をその高い流動条件と優れたサイズの解像度に起因する高レイノルズ数（Re）が13で支配的な揚力（F L）に別個の位置に集中する合理化-より多くの有望なアプローチは、慣性マイクロフルイディクスを伴います。それは、多くの場合、サイズに基づく細胞分離14,15とバッファ交換用途のために利用されている。16-18 Howeve分離した細胞は、通常、元のと新しい緩衝液との間の境界に近い残るように、R、バッファ交換性能が~10-30％、汚染物質溶液で貧しいまま。16-18さらに重要なのは、標的細胞のサイズ分布を達成することは似ているように持っています正確な慣性は、フォーカシング、特にそのような間葉系幹細胞（MSC）のような不均質なサイズの細胞型の処理に問題を提起し、元の緩衝液からの分離。19
我々は以前、新しい慣性マイクロ流体セルソーティング技術は、2-入口、2-アウトレットスパイラルマイクロチャネルデバイスを使用して、循環腫瘍細胞（CTCの）全血から20および細菌21を単離するためのディーン・フロー分画（DFF）と呼ばれる開発しました。このビデオプロトコルでは、我々は、標識THP-1（ヒト急性単球性白血病細胞株）懸濁単球細胞（〜15ミクロン）およびカルセイン-LでのMSC（10-30ミクロン）の処理について説明しますoadedのNP、標識された細胞と結合していないNPの除去を効率的に回収するためのDFFのスパイラルマイクロデバイスの製造および操作が続く。22この一段階精製戦略は、標識されたサスペンション、遠心分離することなく、新鮮な緩衝液に懸濁接着細胞の連続的な回復を可能にします。また、10万個の細胞・ml -1の、再生医療用途のために適した細胞密度まで処理することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載されDFF細胞精製技術は、ハイスループット様式で標識された細胞の迅速かつ継続的な分離を可能にします。この分離法は、大きな試料体積または高細胞濃度の試料処理のために理想的であり、長期間の使用後に目詰まりを起こしやすい従来の膜ベースの濾過よりも良好です。同様に、親和性に基づく磁気分離は面倒かつ高価である追加の細胞標識のステップを必要とします。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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