Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências
Summary
Este protocolo descreve o uso de uma estratégia de troca de tampão à base de microfluidos inercial para purificar as células manipuladas micro / nanopartículas com depleção eficaz de partículas não ligadas.
Abstract
células de engenharia com micro ativo-ingrediente-carregado / nanopartículas (NPs) está se tornando um método cada vez mais popular para melhorar as propriedades terapêuticas nativos, permitem imagiologia bio e controlar fenótipo celular. Um problema crítico é ainda tratado de forma inadequada ao número significativo de partículas que permanecem não ligados após a marcação de células que não podem ser facilmente removidas por centrifugação convencional. Isto leva a um aumento do ruído de fundo de imagem bio e pode conferir efeitos de transformação em células não alvo vizinhos. Neste protocolo, apresentamos uma estratégia inercial baseada em microfluidics tampão de câmbio denominado como Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para separar eficientemente células marcadas de NPs livres de uma forma de alto rendimento. O microdispositivo espiral desenvolvido facilita a recolha contínua (> recuperação de células de 90%) das células purificadas (THP-1 e MSCs) suspensas em solução tampão nova, ao conseguir% depleção de corante fluorescente não ligado ou NPs tingem-carregado (sil> 95ica ou PLGA). Este único passo, estratégia de purificação de células à base de tamanho permite que o rendimento de processamento de alta celular (10 6 células / min) e é altamente útil para a purificação de células de grande volume de células micro / nanopartículas projetada para alcançar uma aplicação clínica livre de interferências.
Introduction
Engenharia células, carregado por agente micro / nanopartículas (NPs) é um método livre de integração, e versátil simples, genômica para melhorar a capacidade bioimaging e aumentar / complementar suas propriedades terapêuticas nativas em medicina regenerativa. 1-3 modificações celulares são alcançados por rotular o membrana plasmática ou citoplasma com um excesso de concentração de NPs carregado por agente para saturar os locais de ligação. No entanto, uma grande desvantagem deste método é a de quantidades significativas de partículas não ligadas que permanece em solução depois de processos de rotulagem de células, que podem potencialmente confundir identificação precisa das células de engenharia de partículas ou complicam resultados terapêuticos 4,5. Além disso, a exposição aos PN contendo transformador agentes (fatores de crescimento, corticosteróides, etc.) em excessivamente alta concentração pode causar citotoxicidade ea exposição mal direcionada pode induzir consequências indesejadas sobre as células não-alvo. Mesmo os transportadores em partículas que compreendem of materiais "biocompatíveis" [por exemplo, poli (ácido co-glicólico), PLGA] pode incitar respostas celulares imunes potentes, em determinadas condições, assim. 6 Este é especialmente perigosa em indivíduos com imunidade diminuída (por exemplo, artrite reumatóide), susceptível de atrasos depuração sistémica de nanopartículas. 7 Assim, a remoção eficiente de partículas livres, antes da introdução das células de engenharia de partículas é de grande importância para minimizar o perfil de toxicidade e reduzir a exposição a partículas carregadas mal dirigido por agente in vivo.
centrifugação em gradiente convencional é muitas vezes usado para separar as células manipuladas de partículas livres, mas é trabalhoso e operado em modo de lote. Além disso, tensões de cisalhamento experimentado pelas células durante a centrifugação de alta velocidade e os elementos constituintes do meio de gradiente de densidade pode comprometer a integridade celular e / ou o comportamento das células influência. 8 microfluídica é uma alternativa atraente, com sevtecnologias de separação rais, incluindo deslocamento lateral determinista (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 e acoustophoresis 12 desenvolvido para a separação de partículas pequenas e aplicações de troca de tampão. No entanto, estes métodos sofrem de baixa taxa de transferência (1-10 ul · min – 1) e são propensos a problemas de entupimento. separações activa, tais como os métodos baseados em dieletroforese também requerem diferenças em fenótipos celulares dieletroforética intrínsecas ou passos adicionais de rotulagem de células para conseguir a separação. Uma abordagem mais promissora envolve microfluídica inercial – a migração lateral de partículas ou células através agiliza a concentrar-se em posições distintas devido a forças de sustentação dominantes (F L) com alto número de Reynolds (Re) 13 Devido às suas condições de alto fluxo e resolução de tamanho superior. , tem sido frequentemente explorados para aplicações de câmbio baseada em tamanho separação de células 14,15 e tampão. 16-18 However, desempenho troca de tampão continua pobre com uma solução contaminante ~10-30% como as células separadas geralmente permanecem perto da fronteira entre soluções originais e novas tampão. 16-18 Mais importante ainda, a distribuição do tamanho das células-alvo deve ser semelhante para alcançar inercial uma focagem precisa e a separação a partir da solução tampão original, que constitui um problema especialmente no processamento de tipos heterogéneos de tamanho de células, tais como células estaminais mesenquimais (MSCs). 19
Temos desenvolvido anteriormente uma nova técnica célula microfluídica inercial de classificação denominado Dean Fluxo Fracionamento (DFF) para isolar células tumorais circulantes (CTCs) 20 e bactérias 21 do sangue total usando a 2 de entrada, dispositivo de microcanal espiral 2-outlet. Neste protocolo de vídeo, iremos descrever o processo de rotulagem de células THP-1 (linha celular de leucemia aguda monocítica humana) monocíticas suspensão (~ 15? M) e MSC (10-30 um) com calceina-lNPs oaded, seguido de fabricação e operação do microdispositivo espiral DFF para a recuperação eficiente de células marcadas e remoção de NPs de não ligados. 22 Esta estratégia de purificação de um só passo permite uma recuperação contínua de suspensão rotulado e as células aderentes em suspensão numa solução tampão fresco sem centrifugação. Além disso, ele pode processar até 10 milhões de células · ml -1, uma densidade de células susceptíveis de aplicações de medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
A tecnologia de purificação de célula DFF aqui descrita permite a separação rápida e contínua de células marcadas de um modo de elevado rendimento. Esta abordagem é ideal para a separação do volume da amostra ou grande processamento de amostras alta concentração de células, e é melhor do que a filtração à base de membrana convencional, que é propenso ao entupimento após uso prolongado. Da mesma forma, a separação magnética baseados em afinidade requer passos adicionais de rotulagem de células que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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