Микрожидкостных буфера обмена для Помехоустойчивое Micro / клеточной инженерии наночастиц
Summary
Этот протокол описывает использование инерциальной микрофлюидики на основе стратегии буфер обмена для очистки микро / наночастиц сконструированные клетки с эффективным истощению несвязанных частиц.
Abstract
Инженерные клетки с активным ингредиентом загруженным микро / наночастиц (NPS) становится все более популярным методом для повышения нативные терапевтические свойства, позволяют био визуализации и контроля клеточного фенотипа. Критическим еще недостаточно поставленный вопрос, является значительное количество частиц, которые остаются несвязанными после мечения клеток, которые не могут быть легко удалены с помощью обычного центрифугирования. Это приводит к увеличению био фонового изображения шума и могут придавать трансформирующие эффекты на соседние не-клеток-мишеней. В этом протоколе, мы представляем инерциальную микрофлюидики стратегию на основе буфера обмена называется, как Дин Flow фракционирования (DFF) эффективно отделить меченые клетки от свободных NPs в высокой пропускной способности способом. Разработанная спираль Микроприбор облегчает непрерывный сбор (> 90% восстановления клеток) очищенных клеток (THP-1 и МСК), взвешенных в новом буферном растворе, при достижении> 95% истощение несвязанного флуоресцентного красителя или красителя загружены NPs (SilВСА или PLGA). Этот одноступенчатый, размер на основе стратегии очистки кювет позволяет использовать пропускную способность обработки высокой клетки (10 6 клеток / мин) и является весьма полезным для очистки клеток большого объема микро / наночастиц инженерии клеток для достижения без помех клинического применения.
Introduction
Инженерной клетки агентом загруженным микро / наночастиц (NPS) представляет собой простой, геномная интеграция свободной и универсальный метод для повышения способности биоимиджинга и увеличить / дополнить свои собственные лечебные свойства в регенеративной медицине. 1-3 Клеточные модификации достигается путем маркировки плазменной мембраны или цитоплазмы с избыточной концентрацией агента загружены NPs насытить сайты связывания. Тем не менее, основным недостатком этого метода является значительное количество несвязанных частиц , оставшихся в растворе после процессов маркировки клеток, которые потенциально могут посрамить точной идентификации частиц инженерии клеток или усложняют результаты лечения. 4,5 Кроме того, воздействие NPs содержащих преобразующей агенты (факторы роста, кортикостероиды и т.д.) , при слишком высокой концентрации может привести к цитотоксичности и неверно направленное воздействие может вызвать непредсказуемые последствия на нецелевые клетки. Даже частицы носители, содержащие OF "биосовместимые" материалы [например, поли (молочной и гликолевой кислоты), ПЛГА] может подстрекать сильнодействующие реакцию иммунных клеток при определенных условиях, а. 6 Это особенно рискованными у лиц с ослабленным иммунитетом (например, ревматоидный артрит) , которые потенциально задержки системный наночастицами зазор. 7 Таким образом, эффективное удаление свободных частиц до введения частиц инженерии клеток имеет большое значение , чтобы минимизировать профиль токсичности и уменьшить неверно направленное воздействие частиц агента загруженным в естественных условиях.
Обычные центрифугирование в градиенте часто используется, чтобы отделить сконструированные клетки от свободных частиц, но является трудоемким и работать в пакетном режиме. Кроме того, касательные напряжения , испытываемые клеток при высокоскоростном центрифугировании и составляющих градиента плотности среды может поставить под угрозу целостность клеток и / или повлиять на поведение клеток. 8 Микрофлюидикс является привлекательной альтернативой с SEVEral технологии разделения включая детерминированной бокового смещения (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 и acoustophoresis 12 , разработанная для разделения мелких частиц и буфера обмена приложений. Однако эти методы страдают от низкой пропускной способностью (1-10 мкл · мин – 1) и склонны к засорению проблем. Активные разделений, такие как диэлектрофореза на основе методов требуют также различия в собственных фенотипов dielectrophoretic клеток или дополнительных шагов маркировки клеток для достижения разделения. Более перспективный подход включает в себя инерциальную микрофлюидики – боковое перемещение частиц или клеток через упорядочивает сосредоточиться на различных позициях из – за доминирующих сил подъема (F L) при высоких числах Рейнольдса (Re) 13 Благодаря своим условиям высокого потока и превосходное разрешение размера. , она часто эксплуатировались размера на основе разделения клеток 14,15 и буферных приложений обмена. 16-18 Howeveг, обмен буфер производительность остается на низком уровне с ~10-30% загрязняющего раствора , как выделенные клетки обычно остаются близко к границе между первоначальным и новым буферных растворов. 16-18 Что еще более важно, распределение размеров клеток – мишеней должен быть похож на достижение точная инерциальная фокусировка и разделение от первоначального буферного раствора , который создает проблему , особенно при обработке гетерогенных размеров типов клеток , таких как мезенхимальных стволовых клеток (МСК). 19
Ранее мы разработали новый метод сортировки инерциальная микрофлюидики клеток называется Dean Flow фракционирования (DFF) для выделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) 20 и 21 бактерии из цельной крови с использованием 2-наливной, 2-выпускную спиральное устройство микроканальных. В этом видео-протокол, мы опишем процесс маркировки ТНР-1 (острый моноцитарный лейкоз линия клеток человека) суспензии моноцитов (~ 15 мкм) и ПКЦ (10-30 мкм) с кальцеиновой-лтины NPs, с последующим изготовлением и эксплуатацией спиральной микроустройство DFF для эффективного извлечения меченых клеток и удаления несвязанных NPs. 22 Эта одна стратегия стадия очистки обеспечивает непрерывное восстановление меченого подвески и прилипшие клетки суспендируют в свежей буферном растворе без центрифугирования. Кроме того, он может обрабатывать до 10 миллионов клеток · мл -1, плотность клеток , поддающихся для применения в регенеративной медицине.
Protocol
Representative Results
Discussion
Технология очистки клеток ДФФ, описанные здесь обеспечивает быстрое и непрерывное разделение меченых клеток в высокой пропускной способности способом. Такой подход разделения идеально подходит для большого объема образца или высокой концентрации клеток в обработке образцов, и лучш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells’ status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
