Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias
Summary
Este protocolo describe el uso de una estrategia de intercambio de tampón a base de microfluídica inercial para purificar células de ingeniería micro / nanopartículas con el agotamiento eficiente de partículas no unidos.
Abstract
células de ingeniería con cargadas con sustancias activas, micro / nanopartículas (NP) se está convirtiendo en un método cada vez más popular para mejorar las propiedades terapéuticas nativas, permitirá bio imágenes y controlar el fenotipo celular. Una cuestión fundamental todavía insuficientemente reconocidos es el importante número de partículas que permanecen sin unir después del marcaje de células que no se pueden eliminar fácilmente mediante centrifugación convencional. Esto conduce a un aumento en el ruido de fondo de imagen bio y puede impartir efectos transformadores en las células no objetivo vecinos. En este protocolo, se presenta una estrategia basada en la microfluídica inercial tampón de intercambio denominado como Decano de flujo de fraccionamiento (DFF) para separar eficientemente las células marcadas de PN libres en una forma de alto rendimiento. El microdispositivo espiral desarrollado facilita la recogida continua (> recuperación de células 90%) de células purificadas (THP-1 y MSC) en suspensión en una nueva solución tampón, mientras que el logro% agotamiento de colorante fluorescente no unido o NPs de tinte cargado (sil> 95ica o PLGA). Esto solo paso, la estrategia de purificación de células basadas en el tamaño hace posible un rendimiento de procesamiento de alta celular (10 6 células / min) y es muy útil para la purificación de células a gran volumen de células micro / nanopartículas de ingeniería para lograr la aplicación clínica libre de interferencias.
Introduction
La ingeniería de células por micro / nanopartículas cargadas con agente (NPS) es un método de integración libre, versátil y sencilla, genómica para mejorar la capacidad de bioimagen y aumentar / suplementar sus propiedades terapéuticas nativos en la medicina regenerativa. 1-3 modificaciones celulares se consiguen mediante el etiquetado de la membrana plasmática o el citoplasma con un exceso de concentración de agente PN-cargado para saturar los sitios de unión. Sin embargo, un inconveniente principal de este método es las cantidades significativas de partículas no unidas que permanece en solución después de los procesos de etiquetado de células, lo que potencialmente puede confundir la identificación precisa de las células de partículas de ingeniería o complicar los resultados terapéuticos 4,5. Además, la exposición a NPs que contienen transformadora agentes (factores de crecimiento, corticoides, etc.) a concentraciones excesivamente altas pueden causar citotoxicidad y la exposición mal dirigida puede inducir consecuencias no deseadas en las células no diana. Incluso los vehículos en partículas que comprende Of materiales "biocompatibles" [por ejemplo, poli (co-glicólico ácido láctico), PLGA] pueden incitar respuestas de las células inmunes potentes bajo ciertas condiciones también. 6 Esto es especialmente arriesgado en individuos con inmunidad comprometida (por ejemplo, artritis reumatoide) que potencialmente retrasos . aclaramiento sistémico de nanopartículas 7 Por lo tanto, la eliminación eficaz de partículas libres antes de la introducción de las células de ingeniería de partículas es de gran importancia para minimizar el perfil de toxicidad y reducir la exposición a las partículas mal dirigido por agente cargado en vivo.
centrifugación en gradiente convencional se utiliza a menudo para separar las células de ingeniería de partículas libres pero es laborioso y operado en modo por lotes. Por otra parte, las tensiones de cizallamiento experimentadas por las células durante la centrifugación de alta velocidad y los constituyentes del medio de gradiente de densidad puede comprometer la integridad de las células y / o comportamiento de las células influencia. 8 microfluídica es una alternativa atractiva con sevtecnologías de separación va- incluyendo el desplazamiento lateral determinista (sistema antibloqueo de frenos) 9, dieletrophoresis 10,11 y 12 acoustophoresis desarrollado para la separación de partículas pequeñas y aplicaciones de intercambio de tampón. Sin embargo, estos métodos sufren de baja rendimiento (1-10 l · min – 1) y son propensos a la obstrucción cuestiones. separaciones activos tales como los métodos basados en dielectroforesis también requieren diferencias de fenotipos de células dielectroforética intrínsecas o pasos adicionales de etiquetado de células para conseguir la separación. Un enfoque más prometedor implica la microfluídica inercial – la migración lateral de partículas o células a través agiliza centrarse en posiciones distintas debido a las fuerzas de elevación dominantes (F L) con alto número de Reynolds (Re) 13 Debido a sus condiciones de alto flujo y la resolución de tamaño superior. , a menudo ha sido explotada para aplicaciones de cambio de separación de células 14,15 basados en tamaño y de amortiguamiento. 16-18 However, el rendimiento sigue siendo pobre intercambio de tampón con solución contaminante ~10-30% como las células separadas suelen permanecer cerca de la frontera entre las soluciones originales y nuevos de amortiguamiento. 16-18 Más importante aún, la distribución del tamaño de las células diana tiene que ser similar para lograr inercial enfoque preciso y la separación de la solución tampón original que plantea un problema especialmente en el tratamiento de los tipos de células-heterogéneos de tamaño, tales como células madre mesenquimales (MSCs). 19
Anteriormente hemos desarrollado una nueva técnica de células de microfluidos inercial de clasificación denomina Dean flujo Fraccionamiento (DFF) para aislar las células tumorales circulantes (CTC) 20 y 21 de las bacterias de la sangre entera usando un 2-entrada, el dispositivo de microcanales espiral de 2 salidas. En este protocolo de vídeo, vamos a describir el proceso de etiquetado de las células THP-1 (línea celular de leucemia monocítica aguda humana) monocıticas suspensión (~ 15 m) y MSC (10-30 micras) con calceína-lNPs oaded, seguido por la fabricación y el funcionamiento del microdispositivo espiral DFF para la recuperación eficiente de células marcadas y la eliminación de NPs no unidos. 22 Esta estrategia solo paso de purificación permite la recuperación continua de suspensión etiquetados y las células adherentes en suspensión en solución tampón fresco sin centrifugación. Por otra parte, se puede procesar hasta 10 millones de células · mL-1, una densidad de células susceptibles de aplicaciones de la medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnología de purificación de células DFF descrito en este documento permite la separación rápida y continua de células marcadas en una forma de alto rendimiento. Este enfoque de separación es ideal para gran volumen de muestra o el procesamiento de muestras de alta concentración de células, y es mejor que la filtración a base de membrana convencional que es propenso a la obstrucción después de un uso prolongado. Del mismo modo, la separación magnética basada en la afinidad requiere pasos adicionales de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.
Materials
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 mL Syringe | BD | 302113 | Syringe 3ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 X 25 X 1 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18mm x 25m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23GA .013 X .25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | .02X.06" 100 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 | |
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