شارك في ثقافة المعيشة Microbiome مع المعوية الزوائد Microengineered الإنسان في الوتر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة
Summary
وصفنا في المختبر بروتوكول للمشاركة في ثقافة الأمعاء microbiome والزغابات المعوية لفترة طويلة باستخدام نظام microphysiological البشري القناة الهضمية على واحد في رقاقة.
Abstract
هنا، نحن تصف بروتوكول لأداء على المدى الطويل المشترك ثقافة متعددة الأنواع البشرية الأمعاء microbiome مع الزغابات المعوية microengineered في جهاز microphysiological البشري القناة الهضمية على واحد في رقاقة. نحن تلخيص واجهة الأنسجة التجويف-الشعرية المعوية في جهاز ميكروفلويديك، حيث يتم تطبيق التشوهات الميكانيكية والفسيولوجية تدفق القص السوائل باستمرار لتقليد التمعج. في متناهية التجويف، الظهارية في الأمعاء كاتشو-2 خلايا الإنسان المثقف لتشكيل "خالية من الجراثيم" زغابة ظهارة وتجديد الزغابات المعوية الصغيرة. يتم تلقيح خلايا الجرثومية قبل مثقف في الجانب التجويف لإنشاء نظام بيئي المضيف ميكروب. بعد تلتزم الخلايا الميكروبية إلى السطح القمي من الزغب، يتم استئناف تدفق السوائل والتشوهات الميكانيكية لإنتاج المكروية ثابتة للدولة التي يتم تزويد مستنبت جديدة باستمرار والبكتيريا غير منضم (وكذلك النفايات البكتيرية) يتم إزالتها بشكل مستمر. بعد تمديد ثقافة مشتركة وأيام مدمج لأسابيع، تم العثور على microcolonies متعددة ليكون موجودا بشكل عشوائي بين الزغب، وعلى حد سواء الجرثومية والخلايا الظهارية تبقى قابلة للحياة وظيفية لمدة أسبوع واحد على الأقل في الثقافة. يمكن تكييفها لدينا بروتوكول التعاون ثقافة لتوفير منصة متعددة للنظم الإيكولوجية في استضافة microbiome الأخرى التي يمكن العثور عليها في مختلف الأعضاء البشرية، التي قد تسهل الدراسة في المختبر من دور microbiome الإنسان في تنظيم الصحة والمرض.
Introduction
أمعاء الإنسان تؤوي مجموعة متنوعة بشكل مذهل من الأنواع الميكروبية (<1000 الأنواع) وعدد هائل من الخلايا الميكروبية (10 مرات أكثر من الخلايا المضيفة الإنسان) والجينات (100 مرة أكثر من الجينوم البشري) 1. هذه microbiomes البشري يلعب دورا أساسيا في استقلاب المواد الغذائية والاكسيوبيوتك، وتنظيم الاستجابات المناعية، والحفاظ على توازن الأمعاء 2. ليس من المستغرب، نظرا لهذه الوظائف المتنوعة والأمعاء microbiome المتعايشة ينظم على نطاق واسع الصحة والمرض 3. وبالتالي، فهم دور microbiome الأمعاء والمضيف ميكروب التفاعلات هي ذات أهمية كبيرة لتعزيز الجهاز الهضمي (GI) الصحة واستكشاف علاجات جديدة للاضطرابات المعوية 4. ومع ذلك، الموجودة في نماذج الأمعاء المختبر (على سبيل المثال، الثقافات ثابتة) تقييد استضافة microbiome ثقافة مشتركة لفترة قصيرة من الزمن (<1 يوم) لأن الخلايا الميكروبية اكتسى وسطا الحاجز المعويوظيفة 5. النماذج الحيوانية البديلة (على سبيل المثال، 6 أو المعدلة وراثيا خالية من الجراثيم الفئران 7) وأيضا لا تستخدم عادة لدراسة المضيف الأمعاء microbiome الحديث المتبادل لأن الاستعمار وصيانة مستقرة من microbiome أمعاء الإنسان من الصعب.
للتغلب على هذه التحديات، وضعنا مؤخرا الإنسان بيوميمتيك "الوتر على واحد في رقاقة" نظام microphysiological (الشكل 1A، يسار) لمحاكاة التفاعلات microbiome المضيف القناة الهضمية التي تحدث في أمعاء الإنسان يعيش 5،8. وmicrodevice القناة الهضمية على واحد في رقاقة يحتوي على اثنين من قنوات ميكروفلويديك موازية مفصولة مرنة، مسامية، المصفوفة خارج الخلية (ECM) غشاء المغلفة مبطنة الظهارية في الأمعاء البشري كاتشو-2 الخلايا، ومحاكاة المعوية واجهة الأنسجة التجويف-الشعرية (الشكل 1A ، يمين) 9. تشوهات متوازن دوري يحركها الفراغ لحث التشوهات الميكانيكية الفسيولوجية التي تحاكي التغيرات عادة inducإد كتبها التمعج (الشكل 1A، يمين). ومن المثير للاهتمام، عندما تزرع كاتشو-2 الخلايا في رقاقة والقناة الهضمية على اساس لأكثر من 100 ساعة، وبشكل عفوي تشكيل ثلاثي الأبعاد (3D) الزغابات المعوية مع منعطفات ضيقة، والحدود فرشاة قمي، وخلايا التكاثري تقتصر على الأقبية القاعدية، إنتاج المخاط، وزيادة النشاط يتفاعل المخدرات (على سبيل المثال، السيتوكروم P450 3A4، CYP3A4)، وتعزيز الجلوكوز امتصاص 8. في هذا المكروية "خالية من الجراثيم، وكان من الممكن أن تشارك في ثقافة بروبيوتيك GG rhamnosus اكتوباكيللوس أو تشكيل العلاجية من خليط بكتيريا بروبيوتيك مع الخلايا الظهارية المضيفة لمدة تصل إلى أسبوعين 5،10.
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول مفصلة لأداء المضيف الأمعاء microbiome ثقافة مشتركة في الجهاز القناة الهضمية على واحد في رقاقة لفترة طويلة. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نناقش القضايا الهامة والتحديات المحتملة للنظر في تطبيق واسع النطاق من هذا ع ثقافة مشتركة في استضافة microbiomerotocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
فهم التفاعلات المضيف microbiome أمر بالغ الأهمية للنهوض الطب. ومع ذلك، ونماذج زراعة الخلايا التقليدية تؤدى في طبق من البلاستيك أو لوحة جيدا ثابتة لا تدعم مستقرة ثقافة مشتركة من الخلايا المعوية الإنسان مع الذين يعيشون الميكروبات الأمعاء لأكثر من 1-2 أيام لأن الخلايا الميك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
