Co-cultuur van de levens- Microbiome met Microengineered Human darmvlokken in een Gut-on-a-Chip microfluïdische apparaat
Summary
We beschrijven een in vitro protocol co-cultuur darm microbioom en darmvlokken voor een langere periode met een menselijke darm-on-a-chip microphysiological systeem.
Abstract
Hier beschrijven we een protocol om op lange termijn co-cultuur van multi-species menselijke darm microbiome voeren met microengineered darmvlokken in een menselijke darm-on-a-chip microphysiological apparaat. We herhalen het darmlumen-capillaire weefsel-interface in een microfluïdische apparaat, waar de fysiologische mechanische vervormingen en vloeistof shear stroming voortdurend worden toegepast op peristaltiek na te bootsen. In het lumen microkanaal, de menselijke darm epitheel Caco-2-cellen worden gekweekt om een 'kiemvrij' villus epitheel te vormen en te regenereren kleine darmvlokken. Pre-gekweekte microbiële cellen geënt in het lumen kant om een gastheer-microbe ecosysteem stellen. Na microbiële cellen zich aan het apicale oppervlak van de villi, vloeistofstroom en mechanische vervormingen worden hervat aan een stationair micro waarin vers kweekmedium constant toegevoerd en ongebonden bacteriën (evenals bacteriële afval) continu verwijderd produceren. Na uitgebreide co-cultuur from dagen tot weken, worden meerdere microkolonies totaal willekeurig worden geplaatst tussen de villi en zowel microbiële en epitheelcellen levensvatbaar blijven en functionele ten minste één week in kweek. De co-cultuur protocol kan worden aangepast om een veelzijdig platform voor andere gastheer-microbiome ecosystemen welke in diverse menselijke organen, die in vitro onderzoek van de rol van menselijke microbiome orkestreren gezondheid en ziekte kunnen vergemakkelijken.
Introduction
De menselijke darm herbergt een verbluffend uiteenlopende reeks microbiële species (<1000 soorten) en een enorm aantal microbiële cellen (10 keer meer dan het humane gastheercellen) en genen (100 keer meer dan het humane genoom) 1. Deze menselijke microbiomes spelen een sleutelrol bij het metaboliseren van voedingsstoffen en xenobiotica, reguleren immuunresponsen en onderhouden intestinale homeostase 2. Niet verrassend, gezien deze diverse functies, de commensal darm microbiome moduleert uitgebreid gezondheid en ziekte 3. Zo is het begrijpen van de rol van de darm microbioom en gastheer-microbe interacties zijn van groot belang voor gastro-intestinale (GI) gezondheid te bevorderen en nieuwe therapieën voor darmziekten 4. De bestaande in vitro modellen darm (bijvoorbeeld statische kweken) beperken gastheer-microbiome co-cultuur een korte periode (<1 dag) omdat microbiële cellen overgroeien en compromis darmwandfunctie 5. Surrogaat diermodellen (bv kiem-vrije 6 of genetisch gemanipuleerde muizen 7) zijn ook niet vaak gebruikt om te studeren gastheer-gut microbioom crosstalk omdat de kolonisatie en stabiele handhaving van de menselijke darm microbiome zijn moeilijk.
Om deze uitdagingen te overwinnen, ontwikkelden we onlangs een biomimetische mens "Gut-on-a-Chip" microphysiological systeem (Figuur 1A, links) op de host-darm microbiome interacties die plaatsvinden in de levende menselijke darm 5,8 emuleren. De darm-on-a-chip micro-inrichting bevat twee evenwijdige microkanalen gescheiden door een flexibel, poreus, extracellulaire matrix (ECM) beklede membraan bekleed met humane intestinale epitheliale Caco-2 cellen nabootsen het darmlumen-capillair weefsel-grensvlak (Figuur 1A , rechts) 9. Vacuüm gedreven cyclische ritmische vervormingen veroorzaken fysiologische mechanische vervormingen dat veranderingen normaal induc na te bootsened door peristaltiek (Figuur 1A, rechts). Interessant wanneer Caco-2-cellen worden gekweekt in de darm-on-a-chip voor meer dan 100 uur, vormen zij spontaan driedimensionale (3D) darmvlokken met tight junctions, apicale borstelzomen, proliferatieve cellen beperkt tot basale crypten, slijmproductie, toegenomen drug metaboliseren activiteit (bijvoorbeeld cytochroom P450 3A4, CYP3A4), en verbeterde glucose heropname 8. In deze "kiemvrij 'micromilieu, was het mogelijk om co-kweek het probioticum Lactobacillus rhamnosus GG of therapeutische vorming van een probiotische bacteriekweek mengsel met menselijke epitheelcellen gedurende twee weken 5,10.
In deze studie beschrijven we het gedetailleerd protocol host-gut microbiome co-kweek uitgevoerd in de darm-on-a-chip apparaat voor een langere periode. Daarnaast bespreken we kritieke problemen en mogelijke uitdagingen in aanmerking komen voor een brede toepassing van deze host-microbiome co-cultuur pROTOCOL.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inzicht in gastheer-microbiome interacties is van cruciaal belang voor het bevorderen van de geneeskunde; Echter, traditionele celkweekmodellen uitgevoerd in een plastic schaal of een statische wells plaat ondersteunt de stabiele co-kweek van menselijke intestinale cellen met levende darmorganismen langer dan 1-2 dagen vanwege microbiële cellen meestal overgroeien de zoogdiercellen in vitro. De overgrowing microbiële populatie snel verbruikt zuurstof en voedingsstoffen, daarna overmatige hoeveelheid van metab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
