Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung
Summary
Wir beschreiben ein in vitro – Protokoll zur Zusammenarbeit Kultur gut microbiome und Darmzotten für einen längeren Zeitraum einen menschlichen Darm-on-a-Chip – microphysiological System.
Abstract
Hier beschreiben wir ein Protokoll langfristige Co-Kultur von Multi-Spezies-menschlichen Darm microbiome mit mikro Darmzotten in einem menschlichen Darm-on-a-Chip-microphysiological Gerät auszuführen. Wir rekapitulieren das Darmlumen-Kapillargewebe Schnittstelle in einer mikrofluidischen Vorrichtung, wo physiologische mechanische Verformungen und Fluidscherströmung sind Peristaltik ständig angewendet zu imitieren. Im Lumen Mikrokanal sind menschliche Darmepithelzellen Caco-2-Zellen, die eine "keimfrei" villus Epithel zu bilden und kleine Darmzotten regenerieren. Vorkultiviert mikrobiellen Zellen werden in die Lumenseite beimpft einen Wirt-Mikroben-Ökosystem zu schaffen. Nach mikrobiellen Zellen an die apikale Oberfläche der Zotten, Fluidströmung und der mechanischen Verformungen haften wieder aufgenommen eine steady-state-Mikroumgebung, in der frisches Kulturmedium zu produzieren konstant zugeführt wird, und ungebundene Bakterien (sowie bakterielle Abfälle) werden kontinuierlich entfernt. Nach längerer Co-Kultur-from Tage bis Wochen, werden mehrere Mikrokolonien gefunden zufällig zwischen den Zotten angeordnet zu sein, und beide mikrobiellen und Epithelzellen bleiben lebensfähig und funktionell für mindestens eine Woche in Kultur. Unsere co-culture – Protokoll kann angepasst werden , eine vielseitige Plattform für andere Host-microbiome Ökosysteme zu schaffen , die in verschiedenen menschlichen Organen gefunden werden können, die in orchestriert Gesundheit und Krankheit in vitro Untersuchung der Rolle des menschlichen microbiome erleichtern.
Introduction
Der menschliche Darm beherbergt eine erstaunlich Vielfalt von mikrobiellen Spezies (<1000 Arten) und eine enorme Anzahl von mikrobiellen Zellen (10 – mal mehr als die menschliche Wirtszellen) und Gene , (100 – mal mehr als das menschliche Genom) 1. Diese menschlichen microbiomes spielen eine Schlüsselrolle in den Nährstoffen und Xenobiotika metabolisierenden, Regulierung Immunantworten und Aufrechterhaltung Darm-Homöostase 2. Es überrascht nicht, da diese verschiedenen Funktionen, die commensal gut microbiome moduliert ausgiebig Gesundheit und Krankheit 3. Somit sind die Rolle des Darms microbiome und Wirt-Mikroben – Interaktionen zu verstehen , von großer Bedeutung , gastrointestinale (GI) zur Förderung der Gesundheit und neue Therapeutika für Darmerkrankungen 4 erkunden. Jedoch bestehenden in vitro Modelle Darm (zB statische Kulturen) host-microbiome Kokultur nach kurzer Zeit (<1 Tag) beschränken , da mikrobielle Zellen überwuchern und kompromittieren DarmbarriereFunktion 5. Surrogate Tiermodellen (zB keimfrei 6 oder gentechnisch veränderte Mäuse 7) sind ebenfalls nicht allgemein zu studieren Host-gut microbiome Übersprechens , weil die Kolonisierung und stabile Aufrechterhaltung des menschlichen Darms microbiome sind schwierig verwendet.
Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir vor kurzem eine biomimetische Mensch "Gut-on-a-Chip" microphysiological System (Abbildung 1A, links) , um die Host-gut microbiome Wechselwirkungen zu emulieren , die 5,8 im lebenden menschlichen Darm vorkommen. Der Darm-on-a-Chip – Mikrovorrichtung enthält zwei parallel mikrofluidischen Kanälen durch eine flexible, poröse, extrazelluläre Matrix (ECM) beschichteten Membran von menschlichen Darmepithelzellen Caco-2 – Zellen ausgekleidet abgetrennt, das Darmlumen-Kapillar – Gewebe – Grenzfläche nachzuahmen (1A 9, rechts). Vakuumgesteuerte zyklische rhythmische Verformungen physiologischen mechanischen Verformungen hervorrufen, die Änderungen nachahmen normalerweise INDUCed durch Peristaltik (1A, rechts). Interessanterweise, wenn Caco-2-Zellen für mehr als 100 Stunden im Darm-on-a-Chip gewachsen sind, sie sich spontan bilden dreidimensionale (3D) Darmzotten mit tight junctions, apikale Bürstensaum, proliferative auf basale Krypten begrenzt Zellen, Schleimproduktion, erhöht Droge metabolisierenden Aktivität (zB Cytochrom P450 3A4, CYP 3A4) und verbesserte Glucose – Wiederaufnahme – 8. In diesem "keimfrei" Mikroumgebung, war es möglich , die probiotische Lactobacillus rhamnosus GG oder eine therapeutische Bildung einer probiotischen Bakterienmischung mit Wirts Epithelzellen für bis zu zwei Wochen 5,10 bis Kokultur.
In dieser Studie beschreiben wir das detaillierte Protokoll Host-gut microbiome Co-Kultur im Darm-on-a-Chip-Gerät über einen längeren Zeitraum durchzuführen. Darüber hinaus diskutieren wir kritische Fragen und mögliche Herausforderungen für eine breite Anwendung dieser Host-microbiome Co-Kultur-p berücksichtigt werdenrotokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Host-microbiome Wechselwirkungen zu verstehen, ist entscheidend für die Medizin voran; jedoch nicht traditionellen Zellkulturmodellen in einer Kunststoffschale oder einem statischen Well – Platte durchgeführt , unterstützen die stabile Co-Kultur von menschlichen Darmzellen mit lebenden Mikroben gut für mehr als 1-2 Tage , weil mikrobiellen Zellen meist die Säugerzellen in vitro überwuchern. Die zuwachs mikrobiellen Population verbraucht schnell mit Sauerstoff und Nährstoffen, anschließend übermäßige …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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