ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養
Summary
私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。
Abstract
ここでは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalデバイスにおけるマイクロ加工腸絨毛を有する多種のヒト腸microbiomeの長期共培養を行うためのプロトコルを記述します。私たちは、生理的機械的変形と流体せん断流れは絶えず蠕動運動を模倣するために適用されるマイクロ流体デバイス、内腸管腔毛細血管組織界面を再現します。ルーメンマイクロチャネルにおいて、ヒト腸上皮のCaco-2細胞は、「無菌」絨毛上皮を形成し、小腸絨毛を再生する培養されます。前培養した微生物細胞は、宿主微生物の生態系を確立するために、ルーメン側に接種します。微生物細胞は、絨毛の先端面に付着した後、流体の流れ及び機械的変形は、新鮮な培養培地を常時供給して未結合細菌（ならびに細菌性廃棄物）である定常状態の微小環境を生成するために再開される連続的に除去されます。拡張された共培養Fの後ROM日週に、複数の微小コロニーを無作為に絨毛の間に位置することが見出されており、両方の微生物および上皮細胞は、培養中で少なくとも1週間生存し、機能しています。私たちの共培養プロトコルは、健康と病気を組織内の人間microbiomeの役割のin vitroでの研究に容易にすることができる様々なヒトの臓器、中に見出すことができる他のホストmicrobiome生態系のための汎用プラットフォームを提供するように適合させることができます。
Introduction
ヒトの腸は、微生物種の驚くほど多様な配列（<千種）と驚異的な微生物細胞の数（ヒト宿主細胞よりも10倍以上）と遺伝子（ヒトゲノムよりも100倍以上）の1を保有します。これらのヒトmicrobiomesは、栄養素および生体異物を代謝免疫応答を調節し、腸のホメオスタシス2を維持する上で重要な役割を果たしています。驚くべきことではないが、これらの多様な機能を考えると、共生腸microbiomeは広く健康と病気3を変調します 。したがって、腸のmicrobiomeとホスト微生物の相互作用の役割を理解することは、胃腸（GI）の健康を促進し、腸の障害4のための新しい治療法を探求するために非常に重要です。しかし、 インビトロでの腸モデル（ 例えば、静置培養） 中に存在するのは時間の短い期間（<1日）微生物細胞が過剰に増殖し、腸の障壁を損なうためにホストmicrobiome共培養を制限します機能5。植民地と人間の腸microbiomeの安定維持が困難であるため、代理動物モデル（ 例えば、無菌6または遺伝子操作マウス7）はまた、一般的にホスト腸microbiomeのクロストークを研究するために使用されていません。
これらの課題を克服するために、我々は最近、生きているヒトの腸5,8で発生したホスト腸microbiome相互作用をエミュレートする「ガット・オン・チップ」microphysiologicalシステム（左図1A）バイオミメティック人間を開発しました。腸オンチップマイクロデバイスは、柔軟な、多孔質、細胞外マトリックス（ECM）は、ヒトの腸上皮のCaco-2細胞が並んでコーティングされた膜、腸管腔毛細血管組織界面（ 図1Aを模倣することによって分離された2つの並列マイクロ流体チャネルが含まれています、右）9。真空駆動型の環状リズミカルな変形は通常induc変更を模倣する生理学的な機械的変形を誘発します（右図1A）蠕動運動によって編。興味深いことに、のCaco-2細胞は、100以上の時間のための腸オンチップで栽培されたとき、彼らは自然にタイトジャンクション、頂端ブラシの境界線、基底陰窩に限定増殖性細胞と3次元（3D）腸絨毛を形成し、粘液産生は、薬物代謝活性（ 例えば、シトクロムP450 3A4、CYP3A4）、および強化されたグルコースの再取り込み8を増加させました 。この「無菌」微小環境では、プロバイオティクスラクトバチルス・ラムノサス GGまたは2週間まで5,10のための宿主上皮細胞とプロバイオティクス細菌の混合物の治療上の形成がする共培養が可能でした。
本研究では、長期間腸オンチップデバイスでホスト腸microbiome共培養を実行するための詳細なプロトコルを記述します。加えて、我々はこのホスト-microbiome共培養Pの広範なアプリケーションのために考慮すべき重要な問題と潜在的な課題を議論しますrotocol。
Protocol
Representative Results
Discussion
ホストmicrobiomeの相互作用を理解することは、医療を進めるために重要です。微生物細胞は、主にin vitroで哺乳動物細胞を過増殖しているためしかし、プラスチック皿または静的ウェルプレートで行われる伝統的な細胞培養モデルは、以上1-2日のために生き腸内微生物とヒト腸細胞の安定な共培養をサポートしていません。過剰成長微生物集団は急速に続いて深刻な腸のバリア機能を損?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
