에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치
Summary
우리는 인간의 장 – 온 – 어 – 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.
Abstract
여기서는 인간 소화관 온 칩 microphysiological 장치 microengineered 장내 융모와 멀티 종 장기적 공 배양 인간 소화관 마이크로 바이을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 우리는 생리 기계적 변형 및 유체 전단 흐름이 지속적으로 연동 운동을 모방 적용되는 미세 유체 장치에서 장 루멘 – 모세관 조직 인터페이스를 요점을 되풀이. 루멘 마이크로 채널에서, 인간의 장내 상피 카코이 세포는 '무균'융모 상피 세포를 형성하고 소장 융모를 재생하는 배양. 전 배양 된 미생물 세포 호스트 미생물 생태계를 확립 내강 측에 접종한다. 미생물 세포가 융모의 선 단면에 부착 한 후, 유체 유동 및 기계적 변형은 정상 상태의 신선한 배지 끊임없이 공급되는 미세 언 바운드 박테리아 (뿐만 아니라 박테리아 폐기물) 연속 제거를 생성 재개된다. 확장 공 배양 후 F주에 ROM 일 여러 microcolonies 임의로 융모 사이에 위치한 것으로 밝혀졌다, 미생물 및 상피 세포 모두 배양 최소 1 주일 동안 생존과 기능을 유지. 더불어 배양 프로토콜은 건강과 질환 조율 인간 마이크로 바이 역할의 시험 관내 연구를 용이하게 할 수있다 각종 인간 장기에서 발견 될 수있는 다른 호스트 마이크로 바이 생태계에 대한 다목적 플랫폼을 제공하도록 구성 될 수있다.
Introduction
인간의 장내 미생물 종의 놀랄만큼 다양한 배열 (<1,000 종)과 엄청난 미생물 세포의 수 (인간 숙주 세포보다 10 배 이상) 유전자 (인간 게놈보다 100 배 이상) 1 항구. 이러한 인간 microbiomes은 영양소 및 대사 생체 이물질 면역 반응을 조절하고, 2 장 항상성 유지에 중요한 역할을한다. 당연히 이러한 다양한 기능 제공, 공생 장내 마이크로 바이 옴은 광범위하게 건강과 질병 (3)을 변조한다. 따라서, 장내 마이크로 바이 옴 및 호스트 – 미생물 상호 작용의 역할을 이해하는 위장관 (GI) 건강 증진 및 장 질환 4에 대한 새로운 치료제를 탐험하기 위해 매우 중요하다. 그러나, 시험 관내 장 모델 (예, 정적 인 배양)에 존재하는 시간의 짧은 기간 (<1 일) 균체 자라다 장내 장벽을 손상하기 때문에 호스트 마이크로 바이에 공 배양을 제한기능 5. 대리 동물 모델 (예를 들어, 무균 6 유전자 조작 생쥐 7)도 일반적으로 식민지와 인간의 장내 마이크로 바이 옴의 안정 유지가 어렵 기 때문에 호스트 장내 마이크로 바이 옴 크로스 토크를 연구하는 데 사용되지 않습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 최근 살아있는 인간 대장 5,8- 발생 호스트 장내 마이크로 바이 상호 작용을 에뮬레이트하기 위해 "거트 온 칩"microphysiological 시스템 (좌도 1a) 생체 모방 인간을 개발 하였다. 창자 – 온 – 어 – 칩 마이크로 디바이스는 유연성, 다공성, 세포 외 기질 (ECM) 인간의 장내 상피 카코이 세포에 의해 줄 지어 코팅 된 막, 장 루멘 – 모세관 조직 인터페이스 (그림 1A을 흉내 낸에 의해 분리 된 두 개의 평행 한 미세 유체 채널을 포함 , 오른쪽) 9. 진공 중심의 순환 리듬 변형은 일반적으로 induc 변경을 모방 생리 기계적 변형을 유도(오른쪽 그림 1A) 연동 운동에 의해 에드. 흥미롭게도, 카코 -2 세포는 100 개 이상의 시간 동안 소화관 온 칩에서 성장 될 때, 자발적 단단히 접합, 정점 브러시 테두리 기저 지하실에 한정되는 증식 성 세포를 3 차원 (3D) 장내 융모를 형성 점액 생산 증가 약물 대사 활동 (예를 들어, 시토크롬 P450 3A4, CYP3A4), 향상된 글루코스 재 흡수 8. 이 '무균'미세 환경에서, 프로 바이오 틱 유산균 rhamnosus의 GG 또는 최대 2 주 5,10에 대한 호스트 상피 세포와 바이오 틱 박테리아 혼합물의 치료 형성하는 공동 문화 수 있었다.
본 연구에서는 장기간 장내 온칩 장치 호스트 장내 마이크로 바이 공동 배양을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 중요한 문제와 잠재적 인 문제를 논의하는 것은이 호스트 마이크로 바이 옴 공동 문화 (p)의 폭 넓은 응용 프로그램에 대해 고려해야 할rotocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
호스트 마이크로 바이 옴의 상호 작용을 이해하는 것은 의학의 발전을 위해 중요하다; 균체 주로 시험 관내에서 포유 동물 세포를 자라다 때문에 플라스틱 접시 또는 정적 웰 플레이트에서 수행 기존의 세포 배양 모델 이상 1-2일 위해 장내 미생물 살아있는 인간의 장 세포의 안정적 공 배양을 지원하지 않는다. overgrowing 미생물 개체군 빠르게 연속적 심각 장 장벽 기능을 손상시키고 장내 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
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