Совместное культивирование жизни микробиомом с Microengineered человека ворсинок кишечника в Gut-на-чипе микрожидкостных устройств
Summary
Описывается протокол в пробирке для совместного культивирования кишечной микробиомом и ворсинок кишечника в течение длительного периода , используя человеческую microphysiological систему кишка-на-чипе.
Abstract
Здесь мы опишем протокол для выполнения долгосрочного сотрудничества культуры нескольких видов человеческого кишечника микробиомом с microengineered кишечных ворсинок в кишечнике человека-на-чипе microphysiological устройства. Резюмируем просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани в микрожидком устройстве, где физиологические механические деформации и сдвигового течения жидкости постоянно применяются для имитации перистальтику. В просвете микроканалов, кишечные эпителиальные клетки Сасо-2 человека культивируют с образованием "стерилен" ворсинок эпителия и регенерации тонкого кишечника ворсинки. Предварительно культивированный микробные клетки инокулируют в сторону светового потока, чтобы установить хост-микробных экосистему. После того, как микробные клетки прилипают к апикальной поверхности ворсинок, поток текучей среды, и механические деформации возобновили производить стационарную микросреду, в котором свежая культуральная среда постоянно подается и несвязанные бактерии (а также бактериальные отходы), непрерывно удаляются. После длительного совместного культивирования FROM дней до нескольких недель, несколько микроколонии оказываются случайным образом расположены между ворсинками, и как микробный и эпителиальные клетки остаются жизнеспособными и функциональной в течение по крайней мере, одну неделю в культуре. Наш протокол совместного культивирования может быть адаптирована для обеспечения универсальную платформу для других хост-микробиомом экосистем , которые могут быть найдены в различных человеческих органов, которые могут способствовать в пробирке изучения роли человеческого микробиомом в оркестровки здоровья и болезни.
Introduction
Кишечник человека таит в себе потрясающе разнообразный спектр видов микроорганизмов (<1000 видов) и огромное количество микробных клеток ( в 10 раз больше , чем клеток – хозяев человека) и гены ( в 100 раз больше , чем в геноме человека) 1. Эти человеческие microbiomes играют ключевую роль в метаболизировать питательных веществ и ксенобиотиков, регуляции иммунных реакций и поддержание гомеостаза кишечника 2. Не удивительно, учитывая эти разнообразные функции, комменсальной кишечника микробиомом широко модулирует здоровье и болезни 3. Таким образом, понимание роли кишечника микробиомом и хост-микробных взаимодействий имеют большое значение для содействия желудочно – кишечного тракта (GI) здоровья и исследовать новые терапевтические средства для лечения кишечных расстройств 4. Тем не менее, существующие в пробирке моделях кишечника (например, статические культуры) ограничивают хост-микробиомом сокультуре на короткий период времени (<1 день) , так как микробные клетки разрастаются и скомпрометировать кишечного барьераФункция 5. Суррогатные модели на животных (например, стерилен 6 или генной инженерии мышей 7) также обычно не используется для изучения хост-кишечную микробиомом перекрестных помех , так как колонизация и стабильное поддержание кишечной микробиомом человека трудно.
Для преодоления этих проблем, недавно мы разработали Biomimetic человека "Gut-на-чипе" microphysiological системы (рис 1А, слева) , чтобы эмулировать микробиомом взаимодействия хост-кишечную , которые происходят в живом человеческом кишечнике 5,8. Микроприбор кишка-на-чипе содержит два параллельных микроканалов , разделенных гибкой пористой, внеклеточного матрикса (ЕСМ) -покрытие мембраны выстлана эпителия кишечника человеческого Сасо-2 клеток, имитируя просвете кишечника-капиллярные интерфейс ткани (рис 1A , справа) 9. Вакуумные управляемые циклические ритмические деформации вызывают физиологические механические деформации, которые имитируют изменения обычно inducред перистальтики (рис 1А, справа). Интересно, что когда клетки Сасо-2 выращивают в микросхеме кишка-на-для более чем 100 часов, они самопроизвольно образуют трехмерную (3D) ворсинок кишечника с плотными соединениями, верхушечных границ кисти, пролиферирующих ограничивается базальных крипт, производство слизи, повышение активности метаболизировать наркотиков (например, цитохром Р450 3А4, CYP3A4), и повышение уровня глюкозы обратного захвата 8. В этом "стерильном" микросреды, это было возможно совместное культивирование пробиотик лактобактерии рамнозус GG или терапевтическое образование пробиотической бактериальной смеси с хозяина эпителиальных клеток в течение двух недель 5,10.
В данном исследовании мы описываем подробный протокол для выполнения хост-кишечную микробиомом совместного культивирования в устройстве кишка-на-чипе в течение длительного периода. Кроме того, мы обсудим важнейшие вопросы и потенциальные проблемы, которые будут рассматриваться для широкого применения этого хозяина-микробиомом сокультуры рrotocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Понимание хост-микробиомом взаимодействия имеет решающее значение для продвижения медицины; Тем не менее, традиционные модели клеточных культур , выполненные в пластиковом блюде или статичным луночного планшета не поддерживают стабильное совместное культивирование клеток кишечник…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
