Co-cultivo de estar con microbioma intestinal humana microconstruidos Villi en una Gut-on-a-Chip dispositivo de microfluidos
Summary
Se describe un protocolo in vitro de co-cultivo microbioma intestinal y vellosidades intestinales durante un periodo prolongado utilizando un sistema de microphysiological gut-on-a-chip humano.
Abstract
A continuación, se describe un protocolo para llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de múltiples especies microbioma intestinal humano con vellosidades intestinales microconstruidos en un dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nosotros recapitular la interfaz de tejido lumen capilar intestinal en un dispositivo de microfluidos, donde las deformaciones mecánicas y fisiológicas flujo de cizallamiento del fluido se aplican constantemente para imitar el peristaltismo. En el microcanal lumen, células epiteliales intestinales Caco-2 humanas se cultivan para formar un epitelio de las vellosidades 'libre de gérmenes' y regenerar pequeñas vellosidades intestinales. células microbianas Pre-cultivadas se inoculan en el lado del lumen para establecer un ecosistema huésped-microbio. Después de células microbianas se adhieren a la superficie apical de las vellosidades, flujo de fluido y deformaciones mecánicas se reanudan a producir un microambiente de estado estacionario en el que se suministra constantemente medio de cultivo fresco y las bacterias no unidas (así como los residuos bacterianos) se eliminan de forma continua. Después de co-cultivo prolongado fdía ROM a semanas, se encuentran varios microcolonias que se encuentra de forma aleatoria entre las vellosidades, y ambos microbiana y células epiteliales permanecen viables y funcional para al menos una semana en cultivo. Nuestro protocolo de co-cultivo se puede adaptar para proporcionar una plataforma versátil para otros ecosistemas huésped-microbioma que se pueden encontrar en diversos órganos humanos, que pueden facilitar el estudio in vitro de la función del microbioma humano en la organización de la salud y la enfermedad.
Introduction
El intestino humano alberga una matriz sorprendentemente diversa de especies microbianas (<1.000 especies) y un enorme número de células microbianas (10 veces más que las células huésped humanos) y genes (100 veces más que el genoma humano) 1. Estos microbiomas humanos juegan un papel clave en el metabolismo de nutrientes y xenobióticos, la regulación de la respuesta inmune, y el mantenimiento de la homeostasis intestinal 2. No es sorprendente, teniendo en cuenta estas diversas funciones, el microbioma intestinal comensal modula ampliamente la salud y la enfermedad 3. Por lo tanto, la comprensión del papel de microbioma intestinal y huésped-microbio interacciones son de gran importancia para promover la salud gastrointestinal (GI) y explorar nuevas terapias para los trastornos intestinales 4. Sin embargo, los modelos existentes en el intestino in vitro (por ejemplo, cultivos estáticos) restringir el co-cultivo de acogida-microbioma de un corto período de tiempo (<1 día) debido a un crecimiento excesivo de células microbianas y comprometen la barrera intestinalFunción 5. Modelos animales sustitutos (por ejemplo, libre de gérmenes 6 o ingeniería genética ratones 7) tampoco se utilizan comúnmente para estudiar anfitrión-gut microbioma diafonía porque la colonización y el mantenimiento estable del microbioma intestinal humana son difíciles.
Para superar estos desafíos, recientemente desarrollamos un ser humano biomimético "Gut-on-a-Chip" sistema de microphysiological (Figura 1A, izquierda) para emular las interacciones huésped-microbioma intestinal que se producen en el intestino humano vivo 5,8. El microdispositivo gut-on-a-chip contiene dos canales de microfluidos paralelas separadas por una, porosa, matriz extracelular flexible (ECM) de la membrana recubierta revestido por epitelio intestinal humano células Caco-2, imitando la interfaz de tejido lumen capilar intestinal (Figura 1A , derecha) 9. deformaciones rítmicos cíclicos de vacío impulsada inducen deformaciones mecánicas fisiológicos que imitan cambios normalmente Induccado por el peristaltismo (Figura 1A, derecha). Curiosamente, cuando se cultivan células Caco-2 en el a-chip gut-on-durante más de 100 horas, se forman espontáneamente en tres dimensiones (3D) vellosidades intestinales con uniones estrechas, bordes en cepillo apical, células proliferativas limitados a criptas basales, la producción de moco, aumento de la actividad de metabolización de fármaco (por ejemplo, el citocromo P450 3A4, CYP3A4), y la glucosa mejorada de la recaptación de 8. En este microambiente 'libre de gérmenes', fue posible co-cultivo el Lactobacillus rhamnosus GG probiótico o una formación terapéutico de una mezcla bacteriana probiótica con las células epiteliales de acogida para un máximo de dos semanas 5,10.
En este estudio, se describe el protocolo detallado para llevar a cabo anfitrión-gut microbioma co-cultivo en el dispositivo gut-on-a-chip para un periodo prolongado. Además, se discuten los problemas y retos críticos potenciales para ser considerado para una amplia aplicación de este alojamiento microbioma-co-cultivo protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La comprensión de las interacciones huésped-microbioma es fundamental para el avance de la medicina; Sin embargo, los modelos de cultivo celular tradicionales realizadas en un plato de plástico o una placa estática no apoyan la estable co-cultivo de células intestinales humanas con microbios intestinales vida de más de 1-2 días porque las células microbianas en su mayoría crecen en exceso las células de mamífero in vitro. La población microbiana overgrowing consume rápidamente oxígeno y nutrientes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
