Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet
Summary
Vi beskriver en in vitro-protokoll för att co-kultur gut microbiome och intestinal villi under en längre tid med användning av en human gut-on-a-chip microphysiological systemet.
Abstract
Här beskriver vi ett protokoll för att utföra långsiktiga samodling av flera arter människans tarm microbiome med microengineered tarmludd i människans tarm-on-a-chip microphysiological enhet. Vi sammanfatta tarm lumen-kapillära vävnadsgränssnittet i en mikroflödessystem enhet, där fysiologiska mekaniska deformationer och fluidfriktionsflöde ständigt tillämpas för att efterlikna peristaltiken. I lumen mikrokanal, humana intestinala epiteliala Caco-2-celler odlas för att bilda en 'bakteriefri' villus epitel och regenerera tunntarms villi. Pre-odlade mikrobiella cellerna inokuleras in i lumen sidan för att etablera en värd mikrob ekosystemet. Efter mikrobiella cellerna vidhäftar till den apikala ytan av villi, är vätskeflöde och mekaniska deformationer återupptogs för att producera en steady-state mikromiljö i vilken färskt odlingsmedium konstant matas och obundna bakterier (såväl som bakteriella avfall) kontinuerligt avlägsnas. Efter förlängd samodling from dagar till veckor, har flera mikrokolonier befunnits vara slumpmässigt placerad mellan villi, och både mikrobiella och epitelceller förbli livskraftig och funktionell för åtminstone en vecka i kultur. Vår samodling protokollet kan anpassas för att tillhandahålla en mångsidig plattform för andra värd-microbiome ekosystem som kan hittas i olika mänskliga organ, som kan underlätta in vitro-studie av den roll som humant microbiome i orchestrating hälsa och sjukdom.
Introduction
Den mänskliga tarmen hyser en förbluffande mångfald av mikrobiella arter (<1000 arter) och ett mycket stort antal av mikrobiella celler (10 gånger mer än de humana värdcellerna) och gener (100 gånger mer än det mänskliga genomet) 1. Dessa mänskliga microbiomes spelar en nyckelroll i metaboliserande näringsämnen och xenobiotika, reglering av immunsvar, och upprätthålla tarm homeostas 2. Inte överraskande, med tanke på dessa olika funktioner, kommen tarmen microbiome modulerar omfattande hälsa och sjukdom 3. Således, förstå betydelsen av tarm microbiome och värd-mikrob-interaktioner är av stor betydelse för att främja gastrointestinal (GI) hälsa och utforska nya läkemedel för tarmsjukdomar 4. Emellertid befintliga in vitro tarmmodeller (t.ex., statiska kulturer) begränsar värd-microbiome sam-kultur till en kort tidsperiod (<1 dag) eftersom mikrobiella celler växa över och äventyra tarmbarriärenfunktion 5. Surrogatdjurmodeller (t.ex. bakteriefri sex eller genetiskt modifierade möss 7) är inte heller vanligt förekommande för att studera värd gut microbiome överhörning eftersom koloniseringen och stabilt upprätthållande av människans tarm microbiome är svåra.
För att övervinna dessa utmaningar, nyligen utvecklade vi en biomimetisk människa "Gut-on-a-chip" microphysiological systemet (Figur 1A, vänster) för att efterlikna de värd gut microbiome samspel som sker i den levande mänskliga tarmen 5,8. Tarmen-on-a-chip mikroanordning innehåller två parallella mikroflödessystem kanaler separerade av en flexibel, porös, extracellulär matris (ECM) -belagda membran kantad av human intestinal epithelial Caco-2-celler, som imiterar den intestinala lumen-kapillära vävnadskontaktytan (Figur 1A , höger) 9. Vakuumdriven cykliska rytmiska deformationer framkallar fysiologiska mekaniska deformationer som efterliknar förändringar normalt Induced av peristaltiken (Figur 1A, höger). Intressant, när Caco-2-celler odlas i tarmen-on-a-chip för mer än 100 timmar, de spontant bilda tredimensionella (3D) tarmludd med tight junctions, apikal borst gränser, proliferativa celler begränsade till basal kryptor, slemproduktion, ökad läkemedelsmetaboliserande aktivitet (t.ex. cytokrom P450 3A4, CYP 3A4) och förbättrad glukosupptags 8. I detta 'bakteriefri' mikromiljö, var det möjligt att co-kultur den probiotiska Lactobacillus rhamnosus GG eller en terapeutisk bildning av en probiotisk bakterieblandning med värdepitelceller för upp till två veckor 5,10.
I denna studie beskriver vi detaljerat protokoll för att utföra värd-gut microbiome samodling i tarmen-on-a-chip-enhet under en längre period. Dessutom diskuterar vi kritiska frågor och potentiella problem att komma ifråga för en bred tillämpning av denna värd microbiome samodling protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förstå värd microbiome interaktioner är avgörande för att främja medicin; emellertid gör traditionella cellodlingsmodeller som utförs i en plastskål eller en statisk brunnsplatta stöder inte den stabila samodling av humana intestinala celler med levande tarm mikrober under mer än 1-2 dagar eftersom mikrobiella celler växa över mestadels däggdjurscellerna in vitro. Den igenväxning mikrobiell population förbrukar snabbt syre och näringsämnen, därefter producerar överdriven mängd metaboliska …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sri Kosuri (Wyss Institute at Harvard University) for providing the GFP-labeled E. coli strain. This work was supported by the Defense Advanced Research Projects Agency under Cooperative Agreement Number W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration under contract #HHSF223201310079C, and the Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University. The views and conclusions contained in this document are those of the authors and should not be interpreted as representing the official policies, either expressed or implied, of the Army Research Office, Army Research Laboratory, Food and Drug Administration, or the U.S. Government. The U.S. Government is authorized to reproduce and distribute reprints for Government purposes notwithstanding any copyright notation hereon.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM glucose and 25 mM HEPES | Gibco | 10564-011 | Warm it up at 37°C in a water bath. |
| Difco Lactobacilli MRS broth | BD | 288120 | Run autoclave at 121°C for 15 min. |
| Poly(dimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1 (w/w), PDMS : cureing agent |
| Caco-2BBE human colorectal carcinoma line | Harvard Digestive Disease Center | Human colorectal adenocarcinoma | |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | 20% (v/v) in DMEM |
| Trypsin/EDTA solution (0.05%) | Gibco | 25300-054 | Warm it up at 37℃ in a water bath. |
| Penicillin-streptomycin-glutamine | Gibco | 10378-016 | 1/100 dilution in DMEM |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Molecular Probes | D1306 | Nuclei staining |
| Phalloidin-CF647 conjugate (25 units/mL) | Biotium | 00041 | F-actin staining |
| Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX5K | Peristalsis-like stretcing motion (10% cell strain, 0.15 Hz frequency) |
| Inverted epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | Imaging, DIC |
| Scanning confocal microscope | Leica | DMI6000 | Imaging, Fluorescence |
| UVO Cleaner | Jelight Company Inc | 342 | Surface activation of the gut-chip |
| Type I collagen | Gibco | A10483-01 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| Matrigel | BD | 354234 | Extracellular matrix component for cell culture into the chip |
| 1 mL disposable syringe | BD | 309628 | Cell and media injection stuff |
| 25G5/8 needle | BD | 329651 | Cell and media injection stuff |
| Syringe pump | Braintree Scientific Inc. | BS-8000 | Injection equipment into the chip |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | A formulation of 8 different commensal gut microbes |
| Reinforced Clostridial Medium | BD | 218081 | Anaerobic bacteria culture medium |
| GasPak EZ Anaerobe Container System with Indicator | BD | 260001 | Anaerobic gas generating sachet |
| 4% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-4-100 | Fixing the cells for staining |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilizing the cells |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | Blocking agent for staining of the cells |
| Corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | Plasma generator for fabrication of the chip |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | Degasing the complete culture medium |
| Disposable hemocytometer | iNCYTO | DHC-N01 | For manual cell counting |
References
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489, 242-249 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C. M., Brett Finlay, B. Gut Microbiota in Health and Disease. Physiol. Rev. 90, 859-904 (2010).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 313-323 (2009).
- Garrett, W. S., et al. Communicable ulcerative colitis induced by T-bet deficiency in the innate immune system. Cell. 131, 33-45 (2007).
- Kim, H. J., Ingber, D. E. Gut-on-a-Chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation. Integr Biol. 5, 1130-1140 (2013).
- Huh, D., Kim, H. J., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nat Protoc. 8, 2135-2157 (2013).
- Kim, H. J., Li, H., Collin, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, E7-E15 (2016).
- Miller, W. G., Lindow, S. E. An improved GFP cloning cassette designed for prokaryotic transcriptional fusions. Gene. 191, 149-153 (1997).
- Odijk, M., et al. Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems. Lab Chip. 15, 745-752 (2015).
- Lentle, R. G., Janssen, P. W. Physical characteristics of digesta and their influence on flow and mixing in the mammalian intestine: a review. J Comp Physiol B. 178, 673-690 (2008).
- Granato, D., et al. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii La1 to human enterocyte-like Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 65, 1071-1077 (1999).
- Dewhirst, F. E., et al. The human oral microbiome. J Bacteriol. 192, 5002-5017 (2010).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Hay, P. E., et al. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. Br Med J. 308, 295-298 (1994).
