유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE (6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 – 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 7 Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다.
시험관 8,9 배양 세포의 세포 증식을 측정하는 다수의 직접 및 간접 방법이있다. 이러한 시간에 따른 연속 측정 또는 종점 분석법 10 중 수행 될 수있다. 기존의 방법은 혈구를 사용하여 세포 계수로, 여전히 유용하다. 이 분석은 낮은 비용과 셀 번호 직접 측정이지만, 계산에서 오류가 큰 표준 편차를 최소화하기 위해 큰 세포 수 및 숙련 된 훈련에 의존 않는다. 고 스루풋 포맷과 호환 측정을 수행 할 필요가 멀티 웰 플레이트 검정의 개발을 유도 하였다. 이 발광 기반 분석은 measu셀 (11, 12)의 대사 활동에 비례하는 발광 신호에 기초하여 세포 수를 재. 최근에, 고 함량의 이미징 플랫폼의 도입 양적 및 질적 표현형 데이터 수집을 제공하는 동안 세포 증식을 모니터링 할 수있는 새로운 도구시키고, 시스템 (13)의 다양한 종류를 포함하고있다. 이들 방법은 모두 연속적인 측정 또는 종점 분석법에 의해 하나, 세포의 성장을 측정하는 길을 제공하며, 각 따라 적절하게 칭량 할 수 모두 감도에 관해서, 시료 번호의 처리량 및 셀 정보 장단점 범위를 가지고 연구 질문에.
이 프로토콜은 감도, 재현성 및 멀티 웰 플레이트 포맷의 다른 범위를 이용하여 각 방법으로 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 혈구 계수 차의 사용과 비교 대상mber 96 시간의 시간 과정을 통해 세포 증식의 측정에 기반 발광 세포 생존력 분석법 및 세포 이미 저. 이를 위해, 벡터 – 형질 도입 된 세포 (MCF-7 LEGO)의 성장은 세 가지 세포 밀도를 사용 Δ40p53 (MCF-7 Δ40p53)를 과발현하는 형질 도입 된 세포와 비교 하였다. 세포 증식은 최대 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다. 각 방법은 자체의 장점 및 단점을 갖는 것으로, 상기 실험의 목적에 따라 각 여전히 증식 속도에 대한 정보를 제공하기위한 유용한 방법 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) 실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
References
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