Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat
Summary
Nous présentons ici un Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) protocole pour étudier les altérations moléculaires à Fos-exprimant ensembles neuronaux de tissu cérébral à la fois frais et congelés. L'utilisation de tissus congelés permet FACS isolement de nombreuses zones du cerveau sur plusieurs sessions afin de maximiser l'utilisation de sujets d'animaux précieux.
Abstract
L'étude de la neuroplasticité et altérations moléculaires dans les comportements appris est de commutation de l'étude des régions du cerveau entier à l'étude des ensembles spécifiques de neurones activés faiblement distribués appelés ensembles de neurones qui interviennent dans les associations apprises. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment été optimisé pour les tissus du cerveau de rat adulte et l'isolement des neurones activés en utilisant des anticorps contre le marqueur neuronal NeuN et de la protéine Fos, un marqueur des neurones fortement activés autorisés. Jusqu'à présent, les neurones Fos exprimant et d'autres types de cellules ont été isolées à partir de tissu frais, ce qui a entraîné jours de traitement longs et a permis un nombre très limité d'échantillons de cerveau pour être évalués après des procédures comportementales longues et complexes. Ici , nous avons constaté que les rendements de neurones et de Fos ARNm de striatum dorsal Fos exprimant étaient similaires entre les tissus fraîchement disséqués et le tissu congelé à -80 ° C pendant 3 – 21 jours. En outre, nous avons confirmé le phénotypedes cellules NeuN-positives et NeuN négatives triées en évaluant l' expression des gènes des neurones (NeuN), astrocytes (GFAP), oligodendrocytaire (Oligo2) et microgial (Iba1) marqueurs, ce qui indique que le tissu congelé peut également être utilisé pour FACS isolement de les types de cellules gliales. Dans l'ensemble, il est possible de recueillir, de disséquer et de geler les tissus du cerveau pour les sessions multiples FACS. Ceci maximise la quantité de données obtenues à partir de sujets animaux précieux qui ont souvent subi des interventions comportementales longues et complexes.
Introduction
Au cours de l'apprentissage, les animaux forment des associations entre des ensembles complexes de stimuli très spécifiques. Cette information à haute résolution est pensé pour être codé par des altérations au sein des modèles spécifiques de neurones faiblement distribués appelés ensembles neuronaux. Ensembles neuronaux ont été récemment identifiés par l'induction de gènes précoces immédiatement (PFGE) tels que Fos, Arc et Zif268 et leurs produits protéiques dans les neurones qui ont été fortement activées pendant le comportement ou l' exposition de repère. Fos-neurones exprimant ont été montré en particulier jouer un rôle causal dans le contexte spécifique et-cue des comportements appris 1-4. Ainsi, neuroadaptations moléculaires uniques dans ces neurones Fos exprimant activés sont les meilleurs candidats pour les mécanismes neuronaux qui codent pour les associations formées au cours des troubles d'apprentissage et d' apprentissage anormal normales, telles que la toxicomanie et le trouble de stress post-traumatique (PTSD) 5 apprises.
Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment permis l'analyse des neuroadaptations moléculaires uniques dans les neurones Fos exprimant. La cytométrie en flux et tri cellulaire ont été développés dans les années 1960 6,7 à caractériser et isoler les cellules en fonction de leurs caractéristiques de diffusion de lumière et immunofluorescence, et sont utilisés depuis longtemps en immunologie et en recherche sur le cancer. Cependant cytométrie en flux et FACS nécessite des cellules individuelles dissociées qui sont difficiles à obtenir du tissu cérébral adulte. A été utilisé pour la première FACS pour isoler et analyser la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant neurones striataux provenant de souris transgéniques qui ne nécessite pas de marquage d'anticorps de 8,9. Nous avons développé un procédé FACS à base d' anticorps 10 pour isoler et évaluer des modifications moléculaires dans les neurones activés par des médicaments et / ou des indices chez les animaux de type sauvage exprimant 11-15 Fos. Dans ce procédé, les neurones sont marqués avec un anticorps contre le marqueur neuronal général NeuN, tandis que les neurones fortement activéssont marqués avec un anticorps contre Fos. Bien que notre méthode initiale nécessaire mise en commun jusqu'à 10 rats par échantillon pour les tissus frais, les modifications ultérieures du protocole permis FACS isolement de Fos exprimant neurones et Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) analyse des zones discrètes du cerveau à partir d' un seul rat 13-15 . Dans l' ensemble, les altérations moléculaires uniques ont été trouvés dans les neurones activés lors d' une variété de comportements et au contexte cue activé dans la recherche sur la toxicomanie 12,14,15 Fos-exprimant.
Un problème logistique majeur à l'exécution de FACS sur tissu frais est qu'il faut une journée entière pour dissocier le tissu et le processus par FACS. En outre, seulement environ quatre échantillons peuvent être traités par jour. Cela signifie généralement qu'une seule zone du cerveau peut être évalué à partir de chaque cerveau et les zones cérébrales restantes doivent être jetés. Ceci est un problème majeur pour faible débit des procédures comportementales telles que l'auto-administration et l'extinction training qui nécessite une intervention chirurgicale et plusieurs semaines de formation intensive. En outre, les procédures comportementales longues et compliquées le jour de test, il est difficile d'effectuer FACS le même jour. Ce serait un avantage significatif pour être en mesure de geler les cerveaux des animaux immédiatement après les tests de comportement, et ensuite isoler les neurones Fos exprimant d'une ou plusieurs zones du cerveau à différents moments de son choix les enquêteurs.
Ici, nous démontrons que notre protocole FACS peut être utilisé pour isoler les neurones Fos exprimant (et d'autres types de cellules) de tissu cérébral à la fois frais et congelés. A titre d'exemple, nous avons isolé des neurones de rat striatum après des injections de méthamphétamine aiguës et de rats naïfs sans injections (condition de contrôle) Fos exprimant. Cependant, ce protocole de FACS peut être utilisé suivant un traitement comportemental ou pharmacologique. Après analyse qPCR de nos échantillons a indiqué que l'expression des gènes à partir de ces types de cellules peut être évaluée avec similar efficacité du tissu à la fois frais et congelés.
Protocol
Representative Results
Discussion
FACS peut être utilisé pour trier les neurones et d'autres types de cellules provenant soit du tissu cérébral adulte frais ou congelé. Comme mentionné dans l'introduction, la possibilité d'utiliser les tissus congelés permet une utilisation optimale des échantillons provenant d'animaux qui ont subi des procédures comportementales complexes et prolongées, comme l'auto-administration et de rechute des études dans la recherche sur la toxicomanie. Ces procédures de comportement prend habitue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.
Materials
| Brain matrix | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | to obtain coronal brain slices |
| Hibernate A low fluorescence | Brain Bits | HA-lf | Buffer A' in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps |
| Accutase | Millipore | SCR005 | Enzyme solution' in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | to prevent cell lost during the protocol |
| Cell Strainer, 40 µm | BD Falcon | 352340 | to filter cell suspension |
| Cell Strainer, 100 µm | BD Falcon | 352360 | to filter cell suspension |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | to do tissue trituration |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody | EMD Millipore | FCMAB317PE | antibody to detect neurons |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Cell Signaling Technology | 8677 | antibody to detect Fos-expressing cells |
| DAPI | Sigma | D8417 | to label nuclei |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems. | KIT0204 | The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells |
| Superscript III first strand cDNA synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | to synthesize cDNA from RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | to do targeted-preamplification from cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Applied Biosystems. | 4444963 | to do PCR using TaqMan probes |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Forward primer | Applied Biosystems. | GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| NeuN Reverse primer | Applied Biosystems. | TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | nucleotide sequence for neuronal gene marker |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker |
| iba-1 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan probe/primers for microglya gene marker |
| Gapdh TaqMan probe | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Gapdh Reverse primer | Applied Biosystems. | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA | nucleotide sequence for reference/housekeeping gene |
| Oligo2 TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker |
| P1000 pipettor | Rainin | 17014382 | It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells |
| 7500 Fast Real-time PCR system | Applied Biosystems. | 446985 | for quantitative PCR |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | for FACS sorting |
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