מתודולוגיה יעילה ופשוט לניתוח במחשב מבוסס התנהגות שחי נמטודות בנוזל מתוארת. השיטה מחייבת לא מעט על מנת השקעה למעבדות C. elegans. החומרה בשימוש הוא רגיל, ואת תוכנת מחשב עבור ניתוח התנהגותי (CeleST) הוא קוד פתוח אחד.
ביתור המעגלים העצביים ועל תוקפת מסדירי התנהגות עדיין מהווה אתגר מרכזי בביולוגיה. נמטודות Caenorhabditis elegans הוכיחו להיות אורגניזם מודל יסולא בפז עוזר להתמודד עם האתגר הזה, מן להפיח גישות טכנולוגיות, בניית connectome המוח האנושי, ממש לשפוך אור על הנהגים מולקולריים הייחודיים של דפוסים תפקודיים בסיסיים. חלק הארי של המחקרים התנהגותיים ב C. elegans בוצע על מצעים מוצקים. בנוזל, חיות מפגינות דפוסי התנהגות הכוללים ינועו בטווח של מהירויות ב -3 D, כמו גם תנועות גוף חלקית, כגון תלתל אחורי ללא שינוי צורה קדמית, אשר מציגות אתגרים חדשים כדי לכמת. השלבים של הליך פשוט, ושימוש תוכנה המאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של C. elegans לשחות התנהגות, מוצגים כאן. התוכנה, בשם CeleST, משתמשת תוכנת מחשב מתמחה העוקבתבעלי חיים רבים בו זמנית ומספק אמצעים הרומן של C. elegans תנועה בנוזל (שחייה). הצעדים מבוססים בעיקר בתנוחת חיה ובהתבסס על מתמטיקה המשמשת ראייה ממוחשבת דפוס הכרה, ללא דרישות חישוביים-offs לחתוך סף. כלי התוכנה יכול לשמש הוא להעריך תעוזת שחייה הכוללת מאה בעלים ממחקרים יצוו קטן משולבים לחשוף פנוטיפים רומן אפילו מוטציות גנטיות היטב מאופיינות. הכנת דגימות לניתוח עם CeleST היא פשוט נמוך-טק, מה שמאפשר הסתגלות רחבה על ידי הקהילה המדעית. השימוש בגישה חישובית המתואר כאן ולכן צריך לתרום להבנה טובה יותר של התנהגות ומעגלים התנהגותי במודל C. elegans.
ההגדרה עד כמה גנטיקה, אפיגנטיקה, ניסיון, והתנהגות השפעה לסביבה הוא אתגר גדול בביולוגיה המודרנית. מודלים פשוטים, גנטי מקובלים כי ניתן לעקוב מחשוב ומדד יכול לתרום קריטי לקראת מטרה זו. נמטודות Caenorhabditis elegans הוא דגם אחד כזה. מטרת מאמר זה היא להדגים כיצד אלגנס לשחות תנועה ניתן לעקוב ונרשמת לחלץ מידע על שמונה תכונות רומן עם הרלוונטיות ביולוגיות.
יש סי אלגנס אורך חיים קצר יחסית של כ 2 – 3 w ותקופה הרבייה של כ 4 ד בטמפרטורה של 20 מעלות 1,2 C. בתרבויות מעבדה סטנדרטיות, נמטודות מיקרוסקופים זה הוא גדלו על צלחות פטרי המכילות מדיה צמיחה נמטודות (NGM) פרוסות עם מקור מזון חיידקי 3,4. חיות WT N2 להזיז פעילות בגלים סינוסי אלגנטיים על צלחות מלאות אגרו; הם משנים את תנועת עכברושes בעת נדידה (המחפשים מזון), מגורים (גלישה), או מחל ארוחה (קפאון שובע פעיל) 5. ירידת ערך 6 או גיל 7-12 גם יכול לשנות התנועה באופן דרמטי על צלחות.
גני מווסתי התנהגות, healthspan או הזדקנות, ניתן לאפיין מבחינה תפקודית על ידי ניתוח דפוסי תנועה אלגנס או תנועה. גישה אחת למדוד healthspan היא לסווג מבוגרי הזדקנות לשלושה סוגים (למשל, A, B, ו- C) על פי התנועה שלהם על צלחות, עם פעילות גופנית נמרצת כיתה להיות ומעמד להיות שיתוק C 7,8,13. למרות מיון ואיכותי הכולל שימושי לחשוף הבדלים בכושר גופני, בקטגוריות רחבות ללא גבולות ברורים ובכך הניקוד שלהם כפוף הנסיין משוא פנים.
מספר גדל והולך של עוקבים העלה את האובייקטיביות, התחכום, ודיוק של הניתוח של C. elegans תנועהעל תקשורת המוצקה 14-18. C. elegans תנועה על צלחות מוגבלת בעיקר למישור שבו החיה יוצרת מגע עם המשטח המוצק של התקשורת. (ג elegans יכול גם לגרום חיפושים ידי הרמת הראש רחוק מהשאר של הגוף כי הוא עדיין בקשר עם משטח מוצק, מיצוב הגוף במטוסים רבים. עם זאת, התנהגות זו היא יוצאת דופן.) כאשר מכניסים נוזל, זה נמטודות יוזם תנועה גלית, או שחייה, כי תכונות תנועה ממדית נרחבת יותר, טווח גדול יותר של מהירות ועומק של תנועה, עלייה בשכיחות עם גיל של הקדמי נע באופן שונה מן האחוריים לעומת חיות על משטחים מוצקים. כתוצאת ניתוח מהיר של כושר גופני ותגובה לסביבה חדשה, נסיין יכול למקם חיה בודדת לתוך טיפת נוזל להבקיע שכיחותו של עיקולי גוף מתחת למשטח הביתור. הקלטת וידאו יכולה להקל scorings הווה והעתיד של מרץ השחייה שלבעל חיים. עם זאת, הגישה הידנית מגבילה את מספר תכונות שיכולים להיות בקיע, והוא מוגבל ומזומן בקיע חיה אחת בכל פעם.
תנועה בנוזל כבר פחות בחנה מ תנועה על תקשורת מוצקה. אכן, יש כמה אפשרויות התוכנה כי הם חזקים וקלים ליישום במעבדה למדוד תנועה בנוזל 19-24. CeleST התוכנה (המבחן לשחות C. elegans) מציע פשטות שימוש והמתמטי מבוססת אמצעים המספקים נתונים (ציוני עקמומיות) רלוונטיים ישירות לאופי התנועה 8; (תיאור מפורט של תכונות ויתרונות Restif et al. 8). יתר על כן, ניתוח חישובית מאפשר להבהרת תכונות פנוטיפי כי הם בלתי אפשריים עבור העין האנושית להבקיע. הנה, נתונים המדגימים את הרזולוציה של גישת ניתוח זה מוצגים קל ליישם פרוטוקול להקליט ניסויים לשחות לניתוח CeleST הבא מתואר.
שימוש סי אלגנס כמערכת מודל ממשיך לגדול עקב הגמישות הגנטית שלו, העקיבות ניסיון ואנטומיה מבואר לפרטים מוקפדים. למשל, המבנה העצבי והקישוריות של אנדרוגינוס אלגנס ממופה בבירור מחוץ 34-36, הקלת חקירות מאוד של מעגלים עצביים ספציפיים ששולטים התנהגויות מסוימות. 302 נוירונים מהווים את מערכת העצבים של אנדרוגינוס המבוגר, אשר תהליך מגוון רחב של מסרים חושיים לתפוקות התנהגותיים בסיסיות כמו תנועה. המבנה של מערכת עצבים הגברית יותר המורכבת אף תואר 37, מה שמאפשר מעגלי מין ספציפי לטפל. 37
התנהגות סי אלגנס נחקרה בהרחבה על צלחות תרבות סטנדרטיות המכילות תקשורת מוצקה. מאז WT C. elegans מהלך בגלים סינוסי לחיזוי על צלחות מלאות אגרו, סטיות מןתבנית כללית ניתן להבחין באמצעות עין וכבש ידני. גישה זו, עם זאת, הוא כפוף של קריטריון הנסיין היא עבודה אינטנסיבית. כלי חומרה ותוכנה שנועדו לעקוב ולמדוד C. elegans תנועה על תקשורת מוצקה להסיר את ההטיה הסובייקטיביות ולאפשר ללימודים בקנה מידה גדולה, המתיר שאלות ביולוגיות מתוחכמות יותר להיות מטופל. המאגר התנהגותי האחרון נוצר על ידי המעבדה שייפר 16 הוא דוגמא מצוינת של הרחבה אנליטית והעומק כי הושג עם מערכת חישובית לתנועה על צלחות.
כאשר WT סי אלגנס מושם בנוזל, החיה מסתגלת בתנועתו במהירות לסביבה החדשה, ייזום לשחות. C. elegans שחייה מנצל מגוון רחב יותר של תנועה מאשר זוחל ויכול להיות יותר סדיר 8. תוכנות כמו CeleST נועדה למלא את הפער עבור ניתוח מפורט של C. elegans התנהגות בנוזל, permiquantitation tting של פרמטרים הקשורים בתנועה שאינו נמדדים בקלות על ידי עין האו"ם בעזרת, או שניתן להשיג במהירות רבה יותר מאשר ניקוד ידני. ב 8 קשה h יחיד יכול לעבד עד 200 סרטונים, ~ 1,000 רשומות ליום.
התוכנה מגדירה שחי פרמטרים בהערכה המשמשים טביעת אצבע מקיפה של כושר גופני והתנהגות. בנוסף להעשרת הבנה של ההיבטים המורכבים של התנהגות אלגנס בנוזל והשבילים המולקולריים שבבסיס שלהם, תוכנה זו יכולה לשמש כדי לחקור היבטים רבים של ביולוגיה ובן התייחסות תרופתית, הזדקנות, התנהגות ברורה. אנו מציגים כאן, בראייה הכוללת של השינויים לכמת המתרחשים התפקוד הפיזי של C. elegans מבוגרים כשהם מזדקנים היא דוגמה אחת של יישום כזה של התוכנה (עבור חשבון מפורט יותר, ראה Restif et al. 8). בהקשר של הזדקנות, פרמטרים שנמדדו כמה ירד תוךאחרים גדלו או לא שינו באופן עקבי סוג בר. מגמות אוששו במידה רבה על ידי הפרופיל חישובית של מוטציות אריכות ימים, ואת הפרופילים היחסיים של קבוצות ילדונת חינניות הרעות של אוכלוסיות מאותו גיל שומרים על תנאים סביבתיים אחידים. הרזולוציה הגבוהה של התוכנה יכולה גם לחשוף פנוטיפים עדין שלא היו ידועים קודם מוטנטים מאופיין בהרחבה (למשל, גיל-1 (hx546) באיור 1).
ישנם כמה שלבים קריטיים במיוחד של הפרוטוקול המתואר. שמירה על סביבת טמפרטורה קבועה בין הסביבה לשחות ואת תרבות צלחת זן חשובה שחזור לשחות, כך מנסה כעת מעודדות מאוד ללכת מאמצים רבים כדי למנוע שינויי טמפרטורה אקראיים. תקשורת לשחות צריכה להיות באותה הטמפרטורה כמו הצלחות. כמו כן, תשומת לב קפדנית את גודל הטיפה עבור לשחות תעזור להבטיח שחזור. לבסוף, זה נבון לחשובמראש על ההעברה של קבצי וידאו גדולים המצטברים. עיבוד תמונות באתר מלבד המחשב לכידת וידאו מומלץ.
השימוש בתוכנה מוצגת כאן לניתוח לשחות יש הגבלות מסוימות. ראשית, למרות התוכניות יכולות לעקוב אחר בעלי חיים מרובים בו זמנית, אם יותר מחמש חיות מנותחות במשותף, יש סיכוי מוגבר כי החיות תשחינה ברחבי לזה את תמונות וידאו. כאשר התוכנית אינה יכולה לקבוע באופן חד משמעי איזו חיה היה אשר, זה מצנזר מסגרות נתונים אלה. למרות תכונת תכנית זו מבטיחה כי נתונים עבור בעלי חיים בודדים הם באיכות גבוהה, היא מגבילה את התפוקה. שנית, התמונה צריכה להיות נקייה למדי, כי הוא חופשי של אבק, לכלוך ובוהק מן האורות, כמו אותות הקשורים גם יכול לבלבל את ניתוח התמונה. כפי שתואר בפרק פרוטוקול 2.1.1, השקעה נמוכה מאוד-טק שיכול מאוד לסייע לכידת תמונה על ידי ביטול סיבוכים עם תנודות in תאורה סביבתית היא לכסות את אזור הבמה עם בד כהה שאינו מאפשר אור הסביבה להגיע לשלב. שלישית, התכנית מותאמת לבעלי חיים בשלב מבוגרים. לשחות זחלים צעירים מאוד מהיר ויש גופים קטנים, אשר מגדיל שגיאה בתכנית. הרביעית, כמה תוכנות מנצל MATLAB, וכאשר ישנם שדרוגי גרסה ו / או שדרוגי מערכת הפעלה, כמה קישורי תכנית עשויים להיות מופר. נכון לעכשיו, התוכנה היא מותאמת לשימוש על 2015b MATLAB ו- Mac OS גרסת 10.10, אולם אנו מצפים בקרוב בכדי לפרסם גרסת תוכנה כי הוא חזק יותר נגד שינויים כאלה. לבסוף, קבצי נתוני וידאו עשויים להיות גדולים מהירים, דורשים שטח אחסון שיוקצו.
לסיכום, המוצגת כאן היא מתודולוגיה פשוטה שניתן ליישם בקלות על ידי כל מעבדה ללא השקעה רבה כדי ליצור קטעי וידאו של C. elegans שחייה לניתוח CeleST. תכונות של חבילת התוכנה כוללות אוטומציה נרחבת של מעקב דרךניתוח, מעקב רב-חי בו זמנית, ושימוש בסיסי מתמטי (כלומר, אמצעי עקמומיות) כדי לכמת את פרמטרי הנידות ביותר. התוכנה היא קוד פתוח, עם קוד והדגמות זמין לציבור כמפורט Restif et al. 8. למרות התכנית כוללת ניתוח ראייה ממוחשבת מתקדם למעקב, מערכות מעקב שפורסם אחרות (למשל, גרינבלום et al., 2014 38) עולים בקנה אחד עם ניתוח הפרמטר של התוכנה המוצגת כאן. שיפורים עתידיים יופנו המרת התוכנה לתוך חבילה חזקה יותר כי אין להגביל את השימוש לגרסות הספציפיות של מערכות ההפעלה הנ"ל (מסומן גם בטבלה של חומרים).
The authors have nothing to disclose.
פיתוח CeleST נתמך על ידי NIH מענקי R21AG027513 ו U01AG045864. נתונים וכמה ייצוגי וידאו קצרים מעובדים מנתונים ואח Restif. (2014) 8, אשר פורסמו תחת רישיון Creative Commons (CC BY) רישיון http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. אנו מודים ריקרדו Laranjeiro לעזרת כתב יד.
REAGENT | |||
N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | C. elegans wild type (ancestral). | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Biosafety Level: BSL-1. | |
OP50-1 Escherichia Coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Streptomycin resistant strain of OP50. Biosafety Level: BSL-1. | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
Printed Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 | have two etched 10mm diameter circles delineated by white ceramic ink |
Nematode Growth Medium (NGM) | For 1L: 17g Agar, 3g NaCl, 2.5g Peptone, 1mL 1M CaCl2, 1mL 5mg/mL Cholesterol in ethanol, 25mL 1M KPO4 buffer, 1mL 1M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
M9 buffer | For 1L: 3g KH2PO4, 6g Na2HPO4, 5g NaCl, 1mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006) | |
EQUIPMENT | |||
CeleST | Driscoll Lab, Rutgers University | C. elegans Swim Test | Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/ |
MATLAB | www.mathworks.com/downloads | MatLab version 2015b (best) | The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs. |
Mac OS | www.apple.com | Version 10.10 | Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab). |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Transmitted Light Base | Diagnostic Instruments | TLB 3.1 | |
Digital CCD Camera | QImaging | Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12) | |
Digital Video Recording Software | Norpix | Streampix Version 3.17.2 |