Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

Summary

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Abstract

Yarrowia lipolytica é um não-patogênicos, dimorfismo e estritamente aeróbias espécies de leveduras. Devido às suas características fisiológicas distintas e características metabólicas, esta levedura não convencionais é não só um bom modelo para o estudo da natureza fundamental de diferenciação de fungos, mas é também uma plataforma microbiana promissora para a produção bioquímica e diversas aplicações biotecnológicas, os quais requerem extensivas manipulações genéticas. No entanto, as manipulações genéticas de Y. lipolytica ter sido limitado devido à falta de um sistema de transformação genética eficiente e estável, bem como muito elevadas taxas de recombinação não homóloga que pode ser atribuída principalmente ao gene Ku70. Aqui, descrevemos um protocolo fácil e rápido para a transformação genética eficiente e para a deleção do gene em Y. lipolytica Po1g. Em primeiro lugar, um protocolo para a transformação eficiente do ADN exógeno em Y. lipolytica Po1g foi estabelecida. SecoND, para atingir a taxa de recombinação homóloga de dupla permutação reforçada para posterior eliminação de genes alvo, o gene Ku70 foi eliminado por transformação de uma cassete de disrupção transportando 1 kb braços de homologia. Em terceiro lugar, para demonstrar a eficiência deleção do gene reforçada após a eliminação do gene Ku70, nós apagadas individualmente 11 genes alvo que codificam álcool desidrogenase e álcool oxidase utilizando os mesmos procedimentos sobre a tensão Ku70 plataforma nocaute. Observou-se que a taxa de recombinação homóloga precisa aumentou substancialmente de menos de 0,5% para eliminação do gene Ku70 em Po1g a 33% -71% para a deleção do gene único dos 11 genes-alvo em Po1g Ku70 Δ. Um plasmídeo replicativo que transporta o marcador de resistência a higromicina B e o sistema Cre / LoxP foi construído, e o gene marcador de selecção nas estirpes knockout de levedura foi finalmente removido por expressão da recombinase Cre para facilitar a múltiplas rondas de targeted manipulações genéticas. Os mutantes de deleção de um único gene resultantes têm potenciais aplicações em biocombustíveis e produção bioquímica.

Introduction

Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, uma levedura convencional, pode crescer sob a forma de levedura ou micélio em resposta a alterações das condições ambientais ^1,2. Assim, esta levedura dimorphic pode ser usado como um bom modelo para o estudo da diferenciação fúngica, a morfogénese e ^3,4,5 taxonomia. É geralmente considerada como uma espécie de levedura seguros (GRAS), que é amplamente utilizado para produzir uma variedade de aditivos alimentares, tais como ácidos orgânicos, poli-álcoois, compostos de aroma, agentes emulsionantes e agentes tensioactivos ^6,7,8,9. É um aeróbio obrigatório e uma levedura oleaginosa bem conhecido capaz de acumular lípidos naturalmente em altas quantidades, isto é, até 70% do peso seco da célula ^10. Também pode utilizar uma vasta gama de fontes de carbono para o crescimento, incluindo diferentes tipos de resíduos nos recursos usados ​​como nutrientes ^11,12,13. Todas estas características únicas fazem Y. lipolytica muito atraente paradiversas aplicações biotecnológicas.

Apesar de toda a sequência do genoma da Y. lipolytica foi publicada ^14,15, manipulação genética desta levedura não convencional é mais complexa do que outras espécies de levedura. Em primeiro lugar, esta transformação de espécies de levedura é muito menos eficiente devido à ausência de um sistema de transformação genética ^16,17 estável e eficiente. Em segundo lugar, a integração genómica laboriosa de cassetes de expressão lineares é normalmente usado para a expressão de genes de interesse que nenhum sistema de plasmídeo epissomal natural foi encontrado nesta levedura ^18. Em terceiro lugar, geração de knock-out genéticos e knock-ins são limitados porque o gene alvo eficiência através de recombinação homóloga precisas neste levedura é baixa ea maioria dos eventos de integração ocorrer até o final não homóloga juntar (NHEJ) ^19.

Neste estudo, nós relatamos um protocolo de transformação otimizada para o Y. lipolytica </em> estirpe Po1g, que é fácil, rápido, eficaz e reprodutível. Para aumentar a frequência de recombinação homóloga preciso, que suprimido o gene Ku70, que codifica uma enzima chave na via NHEJ. Usando o protocolo de transformação optimizado e transformando uma cassete nocaute linear contendo regiões de homologia flanqueadoras de 1 kb, do gene da Ku70 Y. lipolytica Po1g foi excluído com sucesso. A robustez desta metodologia deleção do gene foi então demonstrado pela segmentação álcool desidrogenase e genes de álcool oxidase na estirpe Po1g Ku70 Δ. Observou-se que a estirpe de eliminação Ku70 exibiram uma eficiência consideravelmente mais elevada de genes mediada por recombinação homóloga segmentação do que a da estirpe de tipo selvagem Po1g. Além disso, um plasmídeo de expressão de Cre replicativa que transporta o marcador de resistência à higromicina B foi construída para efectuar recuperação do marcador. A recuperação do marcador facilita várias rodadas de gene alvo in the obtidos os mutantes de deleção do gene. Além deleção do gene, o nosso protocolo para a transformação genética e a deleção do gene aqui descrita pode ser aplicada para inserir genes para loci específicos, e para introduzir mutações específicas do local em Y. genoma lipolytica.

Protocol

1. Geração do Y. lipolytica Ku70 Supressão Strain Construção da cassete de disrupção Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na reacção em cadeia da polimerase (PCR) amplificações. 20 conceber iniciadores para amplificar por PCR a cassete de expressão LEU2 (ver Tabela 1) a partir de um Y. vector de expressão lipolytica e introduzir sítios loxP em 5 'e 3' da cassete de…

Representative Results

A Y. linearizado vector de expressão lipolytica foi inserido na plataforma de encaixe pBR no genoma de Y. lipolytica cepa Po1g através da realização de um único recombinação de crossover 27. Ao utilizar o processo de transformação química rápida estabelecido neste estudo, a Y. linearizado vector de expressão lipolytica foi transformado com sucesso para a estirpe de tipo selvagem Po1g a uma eficiência de transformação …

Discussion

O nosso objectivo para este estudo é permitir a geração rápida e eficiente de nocaute de genes alvo do Y. lipolytica Po1g tensão. Várias considerações devem ser abordadas para conseguir isso. Em primeiro lugar, uma elevada eficiência de transformação é necessária. Assim, um protocolo de transformação química eficiente e conveniente para o Y. lipolytica Po1g estirpe foi descrito no presente estudo. O uso de PEG-4000 é um fator crítico para a transformação bem sucedida desta …

Materials

Reagent/Material
Oligonucleotide primers	Integrated DNA Technologies		25 nmole  DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g	Yeastern Biotech		leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1	Yeastern Biotech	FYY203-5MG	Y. lipolytica expression vector
E. coli TOP10	Invitrogen		For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector	Promega	A3600	TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	For plasmid isolation
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9282	Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity DNA polymerase	Bio-Rad	172-5302	High-fidelity DNA polymerase
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Restriction enzyme
BglII	New England Biolabs	R0144L	Restriction enzyme
KpnI	New England Biolabs	R0142S	Restriction enzyme
NdeI	New England Biolabs	R0111S	Restriction enzyme
NotI	New England Biolabs	R0189L	Restriction enzyme
PmlI	New England Biolabs	R0532S	Restriction enzyme
PstI	New England Biolabs	R0140S	Restriction enzyme
SacII	New England Biolabs	R0157S	Restriction enzyme
SalI	New England Biolabs	R0138S	Restriction enzyme
XhoI	New England Biolabs	R0146L	Restriction enzyme
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq DNA polymerase	Bio-Rad	M0267L
Ampicillin	Gibco-Life Technologies	11593-027	Antibiotics
Hygromycin B	PAA	P21-014	Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder	Thermo Scientific	SM0312	1 kb DNA ladder
PEG4000	Sigma	95904-F
Tris	Promega	H5135
EDTA	Bio-Rad	161-0729
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	15-632-011
Lithium Acetate	Sigma
Acetic acid	Sigma
Glass beads (425-600 µm)	Sigma	G8772
RNAse A	Thermo Scientific	EN0531
DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611
Bacto Yeast Extract	BD	212750
Bacto Peptone	BD	211677
D-Glucose	1st Base	BIO-1101
YNB without amino acids	Sigma	Y0626
DO Supplement-Leu	Clontech	630414
Glycerol	Sigma	G5516
Difco LB Broth	BD	244620
Difco LB Agar	BD	244520
Bacto Agar	BD	214010
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR machine	Biorad	T100 Thermal Cycler
Water bath	Memmert	WNB 14
Stationary/Shaking Incubator	Yihder	LM-570RD
Thermo-shaker	Allsheng	MS-100
Micro centrifuge	Eppendorf	5424R
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer plus
Gel imager	GE	Amersham Imager 600