Summary

Génie génétique d'une levure Unconventional for Renewable Biofuel and Production Biochemical

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.

Abstract

Yarrowia lipolytica est une espèce de levure non pathogènes, dimorphes et strictement aérobies. En raison de ses caractéristiques physiologiques distinctifs et caractéristiques métaboliques, cette levure non conventionnelle est non seulement un bon modèle pour l'étude de la nature fondamentale de la différenciation fongique, mais est également une plate-forme microbienne prometteuse pour la production biochimique et diverses applications biotechnologiques, qui nécessitent de nombreuses manipulations génétiques. Cependant, les manipulations génétiques de Y. lipolytica ont été limités en raison de l'absence d'un système de transformation génétique efficace et stable, ainsi que des taux très élevés de recombinaison non homologue qui peut être principalement attribuée au gène KU70. Nous rapportons ici un protocole simple et rapide pour la transformation génétique efficace et pour la suppression du gène en Y. lipolytica Po1g. Tout d' abord, un protocole pour la transformation efficace de l' ADN exogène dans Y. lipolytica Po1g a été créé. Second, pour atteindre le double croisement taux de recombinaison homologue amélioré pour deletion supplémentaire de gènes cibles, le gène KU70 a été supprimée par la transformation d' une cassette de disruption 1 kb portant homologie bras. Troisièmement, mettre en évidence le gène suppression efficacité accrue après la suppression du gène KU70, nous avons supprimé individuellement 11 gènes cibles codant pour l' alcool déshydrogénase et l' alcool oxydase en utilisant les mêmes procédures sur la souche KU70 de plate – forme de KO. On a observé que le taux de recombinaison homologue précise sensiblement augmenté de moins de 0,5% pour la suppression du gène dans KU70 Po1g à 33% -71% pour la suppression d' un gène unique des 11 gènes cibles dans KU70 Po1g Δ. Un plasmide réplicatif portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B et le système Cre / loxP a été construit et le gène marqueur de sélection dans les souches de levure knock-out a finalement été éliminé par l'expression de la recombinase Cre pour faciliter des cycles multiples de targemanipulations génétiques ted. Les mutants de délétion d'un gène unique résultant ont des applications potentielles dans les biocarburants et la production biochimique.

Introduction

Contrairement à Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, une levure non conventionnelle, peut se développer sous la forme de levure ou mycélium en réponse aux changements des conditions environnementales 1,2. Ainsi, cette levure dimorphique peut être utilisé comme un bon modèle pour l'étude de la différenciation fongique, la morphogenèse et la taxonomie 3,4,5. Il est généralement considéré comme un coffre – fort (GRAS) des espèces de levures, qui est largement utilisé pour produire une variété d'additifs alimentaires , tels que des acides organiques, des polyalcools, des composés aromatiques, des émulsifiants et des agents tensio – actifs 6,7,8,9. Il est un aérobique de obligatoire et une levure oléagineuse bien connu capable d'accumuler naturellement les lipides à des quantités élevées, soit jusqu'à 70% de poids sec des cellules 10. Elle peut aussi utiliser un large éventail de sources de carbone pour la croissance, y compris les différents types de résidus dans le gaspillage de ressources que les nutriments 11,12,13. Toutes ces caractéristiques uniques font Y. lipolytica très attractif pour lesdiverses applications biotechnologiques.

Bien que la totalité de la séquence du génome de Y. lipolytica a été publiée 14,15, manipulation génétique de cette levure non conventionnelle est plus complexe que d' autres espèces de levure. Tout d' abord, la transformation de cette espèce de levure est beaucoup moins efficace en raison de l'absence d'un système de transformation génétique 16,17 stable et efficace. En second lieu , l' intégration génomique laborieuse des cassettes d'expression linéaires est couramment utilisé pour l'expression de gènes d'intérêt car aucun système de plasmide épisomique naturel a été trouvée dans cette levure 18. Troisièmement, la génération de knock-outs génétiques et knock-ins sont limitées parce que le gène efficacité du ciblage par recombinaison homologue précis dans cette levure est faible et la plupart des événements d'intégration se produit à travers l' extrémité non homologue de jonction (NHEJ) 19.

Dans cette étude, nous présentons un protocole de transformation optimisée pour Y. lipolytica </em> souche Po1g, ce qui est facile, rapide, efficace et reproductible. Pour améliorer la fréquence de recombinaison homologue précise, nous avons supprimé le gène KU70, qui code pour une enzyme clé dans la voie NHEJ. En utilisant le protocole de transformation optimisée et la transformation d' une cassette de knock-out linéaire contenant flanquant régions d'homologie de 1 kb du gène de la KU70 Y. lipolytica Po1g a été supprimé. La robustesse de cette méthode de suppression du gène a ensuite été démontrée en ciblant l' alcool déshydrogénase et les gènes de l' alcool oxydase dans la souche Po1g KU70 Δ. On a observé que la souche de deletion KU70 présentait une efficacité nettement plus élevée du gène de la recombinaison médiée par ciblage homologue à celle de la souche Po1g de type sauvage. En outre, une expression réplicatif Cre plasmide portant le marqueur de résistance à l'hygromycine B a été construit pour réaliser le marqueur de sauvetage. Le sauvetage de marqueur facilite plusieurs tours de ciblage de gènes dans ee a obtenu des mutants de deletion de gène. En plus de la suppression des gènes, notre protocole pour la transformation génétique et la suppression du gène décrit ici peut être utilisé pour insérer des gènes à des loci spécifiques et d'introduire des mutations spécifiques au site en Y. lipolytica génome.

Protocol

1. Génération de Y. lipolytica KU70 délétion Strain La construction de la cassette de disruption Note: Voir le tableau 1 pour toutes les amorces utilisées dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifications. Conception des amorces 20 pour amplifier par PCR la cassette d'expression LEU2 (voir le tableau 1) à partir d' un Y. Vecteur d'expression lipolytica et d' introduir…

Representative Results

Y. linéarisé Vecteur d'expression lipolytica a été inséré dans la plate – forme d'arrimage pBR dans le génome de Y. lipolytica souche Po1g en effectuant une simple recombinaison de croisement 27. En utilisant la procédure rapide de transformation chimique établie dans cette étude, le Y. linéarisé vecteur d'expression lipolytica a été transformé avec succès dans la souche Po1g de type sauvage à une effica…

Discussion

Notre objectif pour cette étude est de permettre la génération rapide et efficace de KO de gènes ciblés dans le Y. lipolytica souche Po1g. Plusieurs considérations doivent être abordées pour atteindre cet objectif. Tout d'abord, une grande efficacité de transformation est nécessaire. Ainsi, un protocole de transformation chimique efficace et commode pour le Y. souche lipolytica Po1g a été décrite dans cette étude. L'utilisation de PEG-4000 est un facteur critique…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous reconnaissons avec gratitude le soutien financier de l'Agence nationale de l'environnement de Singapour (ETRP 1.201.102), le Programme de recherche concurrentielle de la National Research Foundation de Singapour (NRF-CRP5-2009-03), l'Agence pour la science, la technologie et la recherche de Singapour ( 1324004108), global R & D Program Project, le Ministère de l'économie du savoir, la République de Corée (N0000677), la Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) et la biologie synthétique Initiative de l'Université nationale de Singapour ( DPRT / 943/09/14).

Materials

Reagent/Material
Oligonucleotide primers Integrated DNA Technologies 25 nmole  DNA oligos
Y. lipolytica strain Po1g Yeastern Biotech leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460)
Vector pYLEX1 Yeastern Biotech FYY203-5MG Y. lipolytica expression vector 
E. coli TOP10  Invitrogen For cloning and propagation of plasmids
pGEM-T vector  Promega A3600 TA cloning vector
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 For plasmid isolation
Wizard SV Gel and
PCR Clean-Up System
Promega A9282 Extract DNA fragments from agarose gels
and purify PCR products from an amplification reaction
The iProof high-fidelity
DNA polymerase
Bio-Rad 172-5302 High-fidelity DNA polymerase
BamHI  New England Biolabs R0136S Restriction enzyme
BglII  New England Biolabs R0144L Restriction enzyme
KpnI New England Biolabs R0142S Restriction enzyme
NdeI  New England Biolabs R0111S Restriction enzyme
NotI New England Biolabs R0189L Restriction enzyme
PmlI New England Biolabs R0532S Restriction enzyme
PstI  New England Biolabs R0140S Restriction enzyme
SacII New England Biolabs R0157S Restriction enzyme
SalI New England Biolabs R0138S Restriction enzyme
XhoI New England Biolabs R0146L Restriction enzyme
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202L
Taq DNA polymerase  Bio-Rad M0267L
Ampicillin Gibco-Life Technologies 11593-027 Antibiotics
Hygromycin B PAA P21-014 Antibiotics
GeneRuler 1 kb DNA ladder Thermo Scientific SM0312 1 kb DNA ladder
PEG4000 Sigma 95904-F
Tris Promega H5135
EDTA Bio-Rad 161-0729
Salmon Sperm DNA Invitrogen 15-632-011
Lithium Acetate Sigma
Acetic acid Sigma
Glass beads (425-600 µm) Sigma G8772
RNAse A Thermo Scientific EN0531
DNA Loading Dye Thermo Scientific R0611
Bacto Yeast Extract BD 212750
Bacto Peptone BD 211677
D-Glucose 1st Base BIO-1101
YNB without amino acids Sigma Y0626
DO Supplement-Leu Clontech 630414
Glycerol Sigma G5516
Difco LB Broth BD 244620
Difco LB Agar BD 244520
Bacto Agar BD 214010
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Biorad T100 Thermal Cycler
Water bath Memmert WNB 14
Stationary/Shaking Incubator Yihder LM-570RD
Thermo-shaker Allsheng MS-100
Micro centrifuge Eppendorf 5424R
Centrifuge Eppendorf 5810R
Spectrophotometer Eppendorf  BioPhotometer plus
Gel imager GE Amersham Imager 600

References

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Yu, A., Pratomo, N., Ng, T., Ling, H., Cho, H., Leong, S. S. J., Chang, M. W. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production. J. Vis. Exp. (115), e54371, doi:10.3791/54371 (2016).

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