إعداد نموذج لتحليل قداس الخلوي
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
كتلة يستخدم الخلوي الأجسام المضادة مترافق مع تسميات المعادن الثقيلة، وهو النهج الذي زاد بشكل كبير من عدد من المعلمات والفرص المتاحة لتحليل عميق إلى ما وراء ما هو ممكن مع تدفق القائم على مضان التقليدية الخلوي. كما هو الحال مع أي تكنولوجيا جديدة، وهناك خطوات الهامة التي تساعد على ضمان الجيل موثوق للبيانات عالية الجودة. المقدمة هنا هو بروتوكول الأمثل الذي يشتمل على تقنيات متعددة لتجهيز عينات من الخلايا لتحليل الخلوي الجماعي. سوف الأساليب المذكورة هنا تساعد المستخدم تجنب المخاطر المشتركة وتحقيق نتائج متسقة عن طريق تقليل التباين، مما قد يؤدي إلى عدم دقة البيانات. لإعلام التصميم التجريبي، وتغطي الأساس المنطقي وراء الخطوات الاختيارية أو بديلة في البروتوكول وفعاليتها في كشف نتائج جديدة في علم الأحياء من نظام يجري التحقيق فيها. وأخيرا، يتم تقديم بيانات تمثيلية لتوضيح النتائج المتوقعة من PRESENTE تقنياتد هنا.
Introduction
الخلوي تمكن من قياس وقت واحد من الأهداف الأجسام المضادة متعددة على مستوى خلية واحدة عبر أعداد كبيرة من الخلايا. في التقليدية التدفق الخلوي القائم على مضان، وعدد من المعلمات التي يمكن قياسها كميا محدودة بسبب التداخل الطيفي بين طيف الانبعاث من fluorophores متعددة، الأمر الذي يتطلب حسابات التعويضات التي تزداد تعقيدا كما يزيد عدد المعلمات. وتعالج هذه القيود من قبل كتلة الخلوي، حيث تم الكشف عن الأجسام المضادة المعادن مترافق الثقيلة وكميا من قبل وقت الرحلة (TOF) مطياف الكتلة لتوسيع كبيرة في عدد من المعلمات التي تم جمعها في وقت واحد وتسفر عن الأبعاد الشخصية نسبة عالية من البروتين وفرة لكل خلية على حدة.
فهم أساسي للعمل من كتلة الخلوي الصك هو مفيد للمستخدم، وربما تكون ضرورية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. للحصول على وصف أكثر دقة من ضبط وتشغيل الجهاز الخلوي الجماعي،انظر المخطوطة ذات الصلة 1. لفترة وجيزة، وصفت عينة الخلية مع لجنة من الأجسام المضادة مترافق المعدنية تستهدف علامات سطح الخلية والبروتينات حشوية، والبروتينات النووية والبروتينات محددة لونين أو غيرها الحواتم الفائدة (الشكل 1I). يتم تحميل الخلايا المسمى على الجهاز، إما في وقت واحد عن طريق الحقن اليدوي أو استخدام الاوتوماتيكى أن عينات من لوحة 96-جيدا. يتم حقن الخلايا تحميلها من خلال البخاخات، والذي يولد رذاذ من قطرات سائلة التغليف الخلايا (الشكل 1ii). يتم وضع هذا الرش بحيث يتم المتأينة الخلايا عن طريق الشعلة الأرجون البلازما. هذا التأين يولد سحابة الجسيمات التي تتألف من جميع الذرات المكونة من كل خلية (الشكل 1iii). كما تنتقل هذه السحابة الجسيمات إلى كاشف، يتم فصل ذرات منخفضة الكتلة الذرية من الأيونات الشامل عالية من قبل مرشح الشامل رباعي. استمرت المتبقية أيونات جماعية عالية لكاشف، حيث abund وكميا تعصب كل النظائر (الشكل 1iv). البيانات الخام التي تم جمعها من قبل كاشف، وتحليلها من قبل كتلة البرنامج الخلوي أداة لتحديد الأحداث الخلية. لكل حدث الخلية التي تم تحديدها، وكميا إشارة الكشف في كل قناة وحفظها إلى ملف ناتج .fcs. القنوات كتلة تستخدم للكشف عن الأجسام المضادة المعادن الثقيلة مترافق يحمل الحد الأدنى من التداخل الطيفي، والتي تتراوح 0-4٪ مع معظم المساهمات أقل من 1٪. وبسبب هذا المنخفض عبر الحديث بين القنوات، وليس من الضروري عموما لتحويل البيانات مع مصفوفة التعويض أمام تحليل 2. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر أثناء تصميم لوحة التجريبية من الأجسام المضادة للتأكد من أن الأجسام المضادة مع حاتمة عالية وفرة-لم يتم تعيين إلى قناة الجماهيرية التي تساهم إشارة إلى قناة المسندة إلى الأجسام المضادة وفرة منخفضة، لأن هذا قد خلق السكاني المرتفع بشكل مصطنع في القناة تلقي مساهمة إشارة.
<p clالحمار = "jove_content"> إعداد الدقيق للعينات لكتلة تحليل الخلوي تعتمد اعتمادا كبيرا على أنواع العينات التي يتم جمعها والفرضية التجريبية التي يجري اختبارها. نحن نقدم أمثلة على بروتوكولين لحصاد أنواع مختلفة من الخلايا (خلايا جذعية جنينية بشرية) والخلايا الأولية (الماوس ورم الثدي الخلايا الظهارية عزل). عند بداية دراسة الخلوي الجماعي، فإنه من المستحسن أن أولا بتنفيذ تجربة رائدة صغيرة للتأكد من أن جميع البروتوكولات والأجسام المضادة ليتم الاستفادة منها تعمل بشكل جيد في يد المحقق. وهذا أمر ضروري وخصوصا عندما تكون لاستخدامها الأجسام المضادة مترافق العرف، كرد فعل تخفيض جزئي خلال تصريف الأجسام المضادة لديه القدرة على تعطيل الجسم المضاد تقارب. لذلك، يحتاج كل الأجسام المضادة مخصصة ليتم التحقق من صحتها تجريبيا لضمان دقة البيانات. وتشمل الاعتبارات الأخرى تحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة سطح الخلية لاستخدامها في فحص ستعترف الحواتم الخاصة بهم بعد تثبيت أو إذا كانت NEإد ليتم تطبيقها على العيش الخلايا. بعض التثبيت قد منع تلطيخ السليم مع الأجسام المضادة سطح الخلية كما هو معروف أن تحدث مع الببتيد MHC تلطيخ 3 و 4. أداء سطح الخلية تلوين الأجسام المضادة على الخلايا الحية قد يكون من الضروري بالنسبة لبعض الأجسام المضادة، ولكن هذا يحول دون خيار المتوازية قبل وضع العلامات الأجسام المضادة كما يتم تنفيذ معظم الطرق المتوازية بعد تثبيت 5 على الرغم من أن القائم على الأجسام المضادة المتوازية 6 و 7 استثناء.عند تحديد عدد الخلايا لتكون على استعداد لتحليل، فمن المهم أن نعرف أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخلايا تحميلها على الجهاز سوف يتم الكشف عن وإنتاج البيانات. ومن المقرر في المقام الأول إلى عدم فعالية هذه الخسارة عندما يرش على البخاخات العينة في الشعلة. فقدان في المئة الدقيقة تعتمد على كتلة الخلوي إعداد الجهاز ونوع من الخلايا ولكن يمكن أن تتراوح 50-85٪ ويجب أن تكونفي الاعتبار عند تصميم التجربة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لالخلايا 2×10 6 لكل عينة ولكن يمكن تكييفها لمعالجة أحجام أصغر أو أكبر عينة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الحد الأدنى من التعديلات لأحجام عينة من 1 × 06-04 أكتوبر × 10 6، ومع ذلك فمن الأهمية بمكان أن تظل حجم العينة بما يتفق ضمن التجربة. التغيرات في عدد الخلايا يمكن أن تؤثر على شدة المتوازية وتلوين الأجسام المضادة ويجب أن تبقى متسقة تقريبا عبر عينات لمقارنة مباشرة.
، ينبغي إجراء بعض الإجراءات، مثل وضع العلامات خلية ميتة ووضع العلامات DNA في الغالبية العظمى، إن لم يكن جميع التصاميم التجريبية. وضع العلامات على الخلايا الميتة في التجارب تحليل فقط علامات سطح يمكن تحقيقه باستخدام Rh103، ولكن Rh103 ينبغي تجنبها للتجارب التي تتطلب permeabilization كما أنه يؤدي إلى فقدان تلطيخ. لالتجارب التي تنطوي permeabilization، فإنه من المستحسن للاستفادة سيسبلاتين <sحتى الطبقة = "XREF"> 8، وعندما يكون ذلك ممكنا، والأجسام المضادة الاعتراف PARP المشقوق أو المشقوق كاسباس للكشف عن خلايا أفكارك والميتة.
يمكن عينات المتوازية خفض استهلاك الأجسام المضادة، وانخفاض اكتساب الوقت والقضاء على عينة إلى عينة تقلب 9. عملية المتوازية ينطوي على تطبيق نموذج التعليمات البرمجية الخاصة فريدة من نوعها لجميع الخلايا، والذي يستخدم لتعيين كل خلية لنموذج المنشأ. بعد المتوازية العينات قد تكون مجمعة قبل تلوين الأجسام المضادة، وهي العملية التي تضمن ملطخة جميع العينات على حد سواء. لتقليل الخطأ التجريبي، فإنه من الحكمة أن الباركود وتجميع أي عينات التي سيتم مقارنة مباشرة مع بعضها البعض. حاليا توجد عدة طرق لالمتوازية عينات للكتلة تحليل الخلوي 5، 6، 7، يتم عرض اثنين منها هنا (انظر أدناه).
مع reagen متاح حاليانهاية الخبر أنه من الممكن تحديد وفرة من 38 أهداف الأجسام المضادة، وتحديد الخلايا في مرحلة S-10، تمييز الخلايا الحية والميتة 8 وقياس مستويات الخلايا من نقص الأكسجين 11 في تجربة المضاعفة من عينات متعددة. هذه القدرة على جمع البيانات خلية واحدة عالية المعلمة للسكان خلية كبيرة تمكن التنميط محسنة من السكان الخلية غير متجانسة للغاية وأنتجت بالفعل عددا من الأفكار البيولوجية الجديدة 12 و 13 و 14 و 15 و 16. تقطير البيانات المعقدة الناتجة على المعلومات التأويل قد يتطلب استخدام الخوارزميات الحسابية بما في ذلك شجرة الامتداد التقدم من كثافة الأحداث تطبيع (SPADE) 17 و 18 viSNE.
تقدم هذه المقالة الوصولنظرة عامة عن كيفية تصميم وتنفيذ كتلة الخلوي التجربة ويقدم التحليل الأساسي للكتلة الخلوي البيانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول المقدمة هنا قد استخدمت بنجاح لمعالجة مختلف خطوط مثقف الخلايا (H1 و H9 hESCs، mESCs، MCF7، HEK 293، KBM5، HMEC، MCF10a) وعينات الأنسجة الابتدائية (الماوس نخاع العظام، والماوس الكبد الجنينية، والكبار الماوس الكبد والورم الماوس). بغض النظر عن المصدر، أي نوع من الأنسجة التي يمكن فص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
References
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
