样品制备质谱术分析
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
质谱术利用具有重金属的标签，这种方式大大增加了参数和深入的分析机会的数量远远超出什么是可能的流式细胞术常规的基于荧光的偶联流抗体。正如任何新技术，有利于保证可靠的新一代高品质数据的关键步骤。这里介绍的是一个优化的协议了采用多种技术用于细胞样品的大规模细胞仪分析的处理。这里所描述的方法将帮助用户避免常见的陷阱，并通过减少可变性，从而导致不准确的数据实现一致的结果。为了通知实验设计，在后面的协议和它们在被调查系统的生物学发现新的发现功效任选的或可替代的步骤的理由被覆盖。最后，有代表性的数据以说明从技术presente预期效果这里天。
Introduction
流式细胞术使多个抗体靶的同时测量在跨越大量人口细胞的单细胞水平。在传统的基于荧光的流式细胞仪中，可以量化参数的数量，由多个荧光团的发射光谱，这需要日益复杂的补偿计算作为参数的数量增加时之间的光谱重叠限制。这些限制由质量流式细胞术，其中检测和通过飞行时间（TOF）质谱法的时间，大大扩大的同时收集的参数的数量和产生高维蛋白丰度分布为每个单独的小区量化重金属结合的抗体处理。
质量血细胞计数仪的工作的基本的理解是有利于用户，并且可以是用于故障诊断至关重要。用于调谐的更透彻的描述和运行质量术机，请参阅相关的手稿1。简言之，将细胞样品标记有靶向细胞表面标记物，细胞质蛋白，核蛋白，染色质结合的蛋白质或感兴趣（ 图1i）中其它表位金属缀合的抗体的面板。将标记的细胞被装载到机器上，或者在一个通过手动注射时间或使用自动进样器，其从96孔板的样品。所加载的细胞通过喷雾器，其产生液滴包封细胞（ 图1II）的喷雾喷射。这种喷雾被定位成使得所述细胞通过在氩等离子炬电离。这种电离产生由每个小区（ 图1iii）的所有构成原子的粒子云。作为这种粒子云行进到所述检测器，低原子质量原子从高质量离子通过四极质量过滤器分离。剩余的高质量离子继续到检测器，其中所述abund各同位素的ANCE进行定量（ 图1iv）。由检测器收集的原始数据，由质量血细胞计数仪软件分析，以确定细胞事件。对于每一个识别的小区时，在每个信道检测的信号进行量化，并保存到输出.fcs文件。用于检测重金属缀合抗体的质量信道表现出最小的光谱重叠，其中从0-4％的范围内具有低于1％，最贡献。因为信道之间的这种低的串扰，所以一般不需要分析2之前与补偿矩阵来转换数据。然而，应注意的抗体的实验面板的设计期间进行，以确保具有高丰度表位的抗体没有分配给有助于信号分配给一个低丰度抗体的信道的质量的信道，因为这可能创建在信道接收所述信号贡献人为的高人口。
<p cl屁股="“jove_content”">大规模仪分析样品的确切制剂是高度依赖于类型的样品被收集和实验假设正在测试中。我们提供的两个协议实例用于收获的不同类型的细胞（人胚胎干细胞）和原代细胞（小鼠乳腺肿瘤上皮细胞分离物）。当开始大规模研究流式细胞术，最好是先进行小试实验，以确保所有的协议和抗体被用来在研究者手中运作良好。这是特别必要时要使用的自定义缀合抗体，该抗体缀合过程中的部分还原反应有可能破坏抗体亲和力的潜力;因此，每个自定义抗体需要凭经验验证，以确保数据的准确性。其他考虑因素包括：确定在测定中使用固定之后将认识到它们的表位的细胞表面的抗体，或者如果他们NE要被施加到编活细胞。如已知与肽-MHC染色3,4发生一些固定可以阻止正常染色与细胞表面的抗体。活细胞上进行细胞表面抗体染色可以针对一些抗体是必要的，但是这排除，因为大多数条形码方法固定后5虽然基于抗体的条形码6中 ，7是一个例外执行之前抗体标记条形编码的选项。当确定细胞的数目，以用于分析来制备，重要的是要知道，只有加载到机器中的细胞的一小部分将被检测到，并产生数据。这种损失主要是由于低效当喷雾器喷洒在焊炬的样品。确切的损失百分比取决于质量流式细胞机设置和细胞类型，但范围可以从50-85％，并且要设计实验时考虑。该协议具有用于每个样品2×10 6个细胞被优化，但可适合于处理更小或更大的样本大小。该协议可以以最小的修改来用于样品尺寸从1×10 6至4×10 6，但它是非常重要的样本大小被保持一个实验内是一致的。细胞数目的变化可影响条形码和抗体染色的强度和对面直接比较样品应保持大致一致的。
一些程序，如死细胞标记和DNA标记，应在绝大多数的进行，如果不是全部的实验设计。可使用Rh103实现死细胞的实验中仅分析表面标记的标签，但Rh103应避免其中，因为它导致染色损失需要透实验。对于涉及通透试验，最好是利用顺铂<s向上类=“外部参照”> 8，并且在可能时识别切割的PARP或裂解的caspase的抗体检测凋亡和死细胞。
条形码的样品可以降低抗体的消耗，减少捕获时间和消除样品到样品的可变性9。条形码的方法，涉及将唯一的特定示例代码的所有小区，这是用来给每个小区分配到其起源的样品。条形编码样品后可先于抗体染色，以确保所有样品被相等地染色的过程中合并。为了最大限度地减少在实验误差，它是明智的条形码和池将被直接相互比较的任何样品。目前存在用于条形编码样品质量仪分析5，6，7，其中两个是这里提出（见下文）的几种方法。
目前可用reagenTS有可能量化的38个抗体目标的丰度，确定在S期10个细胞，区分活细胞和死细胞8和多个样本的复用实验测量缺氧11的细胞水平。此收集高参数单细胞数据大细胞群体的能力能够改进高度异质的细胞群的分析，并且已经产生了一些新的生物洞察12，13，14，15，16的。蒸馏所产生的复杂的数据可解释信息需要运用的计算算法包括密度归一化活动的生成树进展（SPADE）17和18 viSNE。
本文介绍了访问的概述如何设计和进行质量流式细胞实验，并引入质量术数据的基本分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的协议已被成功地用于各种培养的细胞系（H1和H9胚胎干细胞，mESCs，MCF7，HEK 293，KBM5，HMEC，MCF10A）和伯组织样品（小鼠骨髓，小鼠胚胎肝，小鼠成年的处理肝，小鼠肿瘤）。不管源，可以解离成单细胞，同时保留所述蜂窝状态应该是适合于通过质量分析仪，但可能需要一些协议优化任何组织。需要注意的是一些表位可以通过使用特定的解离，固定和渗透的治疗受到影响，这些方法可能需…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
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