Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Mass cytometri benytter antistoffer konjugeret med tungmetal etiketter, en tilgang, der i høj grad har øget antallet af parametre og muligheder for dyb analyse langt ud over hvad der er muligt med konventionelle fluorescens-baserede flowcytometri. Som med enhver ny teknologi, der er kritiske trin, der hjælper sikre en pålidelig generation af data af høj kvalitet. Præsenteres her, er en optimeret protokol, der inkorporerer flere teknikker til forarbejdning af celleprøver til masse-cytometri-analyse. De her beskrevne metoder vil hjælpe brugeren undgå almindelige faldgruber og opnå ensartede resultater ved at minimere variabilitet, hvilket kan føre til ukorrekte oplysninger. At informere forsøgsdesign, er rationalet bag valgfrie eller alternative trin i protokollen og deres effektivitet i at afdække nye resultater i biologi af systemet blive undersøgt dækket. Endelig er repræsentativ data for at illustrere forventede resultater fra teknikker presented her.

Introduction

Cytometri muliggør samtidig måling af flere antistofmål på en enkelt celle niveau i store populationer af celler. I traditionel fluorescens-baserede flowcytometri, er antallet af parametre, som kan kvantificeres begrænset af spektral overlapning mellem emissionsspektret af flere fluoroforer, som kræver mere komplekse kompensationsberegninger som antallet af parametre stiger. Disse begrænsninger er rettet efter masse cytometri, når der konstateres tungmetalfrie konjugerede antistoffer og kvantificeres ved flyvetid (TOF) massespektrometri i høj grad at udvide antallet af parametre, der er indsamlet samtidigt og give en høj dimensionel protein-overflod profil for hver individuel celle.

En grundlæggende forståelse af arbejdet i massen cytometri instrument er til gavn for brugeren og kan være afgørende for fejlfinding. For en mere grundig beskrivelse af tuning og kører en masse cytometri maskine,under det relaterede manuskript ^1. Kort beskrevet en celleprøve mærket med et panel af metal konjugerede antistoffer rettet celleoverflademarkører, cytoplasmatiske proteiner, kerneproteiner, kromatin-bundne proteiner eller andre epitoper af interesse (Figur 1i). De mærkede celler fyldt på maskinen, enten en ad gangen ved manuel injektion eller ved hjælp af en autosampler at prøver fra en 96-brønds plade. De fyldte celler injiceres gennem en forstøver, som frembringer en spray af små væskedråber, der indkapsler cellerne (Figur 1ii). Denne spray er anbragt således, at cellerne ioniseres af en argon plasmabrænderen. Denne ionisering frembringer en partikel sky består af alle de indgående atomer i hver celle (figur 1iii). Da denne partikel sky bevæger til detektoren, er lave atommasse- atomer adskilt fra de høje masse ioner ved en kvadrupol filter. De resterende høje masse ioner fortsætter til detektoren, hvor abundstemmelse af hver isotop kvantificeres (fig 1iv). De rå data indsamlet af detektoren, analyseres ved massen cytometri instrument software til at identificere celle begivenheder. For hver identificeret celle omstændigheder er detekteret i hver kanal signal kvantificeres og gemmes til en udgang .fcs fil. Massen kanaler, der anvendes til detektering af de tungmetal konjugerede antistoffer udviser minimal spektral overlapning, der spænder fra 0-4% med de fleste bidrag under 1%. På grund af denne lave krydstale mellem kanalerne, er det generelt unødvendigt at transformere dataene med en kompensation matrix før analyse ^2. Imidlertid bør man være omhyggelig under udformningen af ​​den eksperimentelle panel af antistoffer for at sikre, at et antistof med en høj forekomst epitop ikke er tildelt en masse kanal, der bidrager signal til en kanal tildelt til en lav overflod antistof, da dette kan skabe et kunstigt højt befolkning i kanalen modtager signalet bidrag.

<p class = "jove_content"> Den nøjagtige fremstilling af prøver til massen cytometrianalyse er stærkt afhængig af de typer prøver indsamles og den eksperimentelle hypotese, der testes. Vi giver eksempler på to protokoller til høst forskellige typer af celler (humane embryonale stamceller) og primære celler (muse brysttumor epitelcelle afsondring). Når der begynder en masse cytometri undersøgelse, er det tilrådeligt først at foretage en lille pilotforsøg for at sikre, at alle protokoller og antistoffer, der skal anvendes fungerer godt i undersøgerens hænder. Dette er især vigtigt, når der skal anvendes brugerdefinerede konjugerede antistoffer som den delvise reduktion reaktion under antistofkonjugation har potentialet til at forstyrre antistofaffinitet; derfor skal valideres empirisk for at sikre nøjagtigheden af ​​data hver tilpasset antistof. Andre overvejelser indbefatter bestemmelse om celleoverflade antistoffer, der skal anvendes i assayet vil erkende deres epitoper efter fiksering eller hvis de Need, der skal anvendes til levende celler. Nogle fiksering kan forhindre korrekt farvning med celleoverflade antistoffer som vides at forekomme med peptid-MHC-farvning ^{3, 4.} Udførelse celleoverfladen antistoffarvning på levende celler kan være nødvendigt for nogle antistoffer, men dette udelukker muligheden for barcoding før antistofmærkning som de fleste Stregkodeprodukter metoder udføres efter fiksering ⁵ selvom antistofbaseret stregkoder ^{6, 7} er en undtagelse.

Ved bestemmelse af antallet af celler, der skal fremstilles til analyse, er det vigtigt at vide, at vil blive opdaget kun en brøkdel af cellerne læsset på maskinen og producerer data. Dette tab skyldes primært ineffektivitet når forstøveren sprøjter prøven ved brænderen. Den nøjagtige procent tab afhænger af massen cytometri setup maskine og celletype, men kan variere fra 50-85% og bør væreovervejes ved udformningen af ​​forsøget. Denne protokol er blevet optimeret til 2×10 ⁶ celler per prøve, men kan tilpasses til forarbejdning mindre eller større prøvestørrelser. Denne protokol kan anvendes med minimale modifikationer til prøvestørrelser fra 1 x 10 ⁶ til 4 x 10 ^6, men det er kritisk, at prøvens størrelse holdes konsistente inden et eksperiment. Ændringer i celleantal kan påvirke intensiteten af ​​stregkoder og antistoffarvning og bør holdes nogenlunde konsistent mellem prøver, der skal sammenlignes direkte.

Nogle procedurer, såsom døde celle mærkning og DNA-mærkning, skal udføres i langt de fleste, hvis ikke alle eksperimentelle design. Mærkningen af ​​døde celler i eksperimenter analyse kun overflademarkører kan opnås ved anvendelse Rh103, men Rh103 bør undgås i eksperimenter, hvor permeabilisering er påkrævet da det resulterer i farvning tab. For eksperimenter, der involverer permeabilisering, er det tilrådeligt at udnytte cisplatin <sop class = "xref"> 8 og, når det er muligt, at et antistof, der genkender spaltet PARP eller spaltes Caspase påvise apoptotiske og døde celler.

Stregkodning prøver kan reducere antistof forbrug, mindske erhvervelse tid og fjerne prøve-til-prøve variabilitet ^9. Processen med barcoding involverer påføring af en unik prøve-specifik kode til alle celler, som anvendes til at tildele hver celle til sin prøve af oprindelse. Efter stregkodning prøverne kan samles forud for antistoffarvning, en proces, der sikrer alle prøver er plettet ligeligt. For at minimere eksperimentelle fejl, er det klogt at stregkode og samle eventuelle prøver, der skal direkte i forhold til hinanden. Øjeblikket findes der flere metoder til stregkodning prøver til massen cytometrianalyse ^{5, 6, 7,} hvoraf to er vist her (se nedenfor).

Med i øjeblikket tilgængelig reagents er det muligt at kvantificere den overflod af 38 antistofmål, identificere celler i S-fase ^10, skelne levende og døde celler ⁸ og måle cellulære niveauer af hypoxi ¹¹ i en multiplekset eksperiment af multiple prøver. Denne evne til at indsamle høj parameter enkelt celle data for store cellepopulationer giver bedre profilering af meget heterogene cellepopulationer og har allerede givet en række hidtil ukendte biologiske indsigter ^{12, 13, 14, 15, 16.} Destillation af den resulterende kompleks data til fortolkelige oplysninger har krævet anvendelse af beregningsmæssige algoritmer herunder Spanning Tree Progression af Density Normaliseret Events (SPADE) ¹⁷ og visne ^18.

Denne artikel præsenterer en tilgængeligoverblik over, hvordan man designer og gennemfører en masse cytometri eksperiment og introducerer grundlæggende analyse af masse-cytometri data.

Protocol

1. Celle Høst Høst celler fra primært væv BEMÆRK: Den for høst af celler fra primært væv proces er specielt anvendelig til muse brysttumorvæv og kan ikke være anvendelige som er til primære væv fra andre kilder. Forberede digestionspuffer ved at opløse 5 mg hyaluronidase og 30 mg collagenase i 10 ml DMEM / F12-medium per gram væv, der skal behandles. Filter sterilisere digestionspuffer. Isoler primær mælkekirtel tumor fra mus og optage tumorvægt. </l…

Representative Results

Protokollen præsenteres her kan bredt anvendes til en bred vifte af dyrkede og primære celleprøver med kun mindre modifikationer. Afhængig af kravene til forsøget, kan den udføres i en modulær måde, når visse elementer, såsom stregkoder eller celleoverfladefarvning, er ikke nødvendige. Anvendes i sin helhed denne protokol muliggør fremstillingen af ​​multiplekserede masse cytometri prøver mærket til døde udelukkelse celle, S-fase population identifikation og farvet til…

Discussion

Protokollen præsenteres her er med held blevet anvendt til behandling af forskellige dyrkede cellelinier (H1 og H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) og vævsprøver primære (mus knoglemarv, muse embryonale lever, muse voksen lever, musetumor). Uanset kilden, ethvert væv, der kan dissocieres i enkeltceller samtidig bevare den cellulære tilstand bør være modtagelige for analyse efter masse cytometri, men kan kræve nogen protokol optimering. Det er vigtigt at bemærke, at nogle epitoper kan blive påv…

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239