Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse Cytométrie

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Masse utilise cytométrie anticorps conjugués avec des étiquettes de métaux lourds, une approche qui a considérablement augmenté le nombre de paramètres et les possibilités d'une analyse approfondie bien au-delà de ce qui est possible avec la cytométrie de flux par fluorescence conventionnelle. Comme pour toute nouvelle technologie, il y a des étapes essentielles qui contribuent à assurer la production fiable de données de haute qualité. Présenté ici est un protocole optimisé qui intègre plusieurs techniques pour le traitement des échantillons de cellules pour l'analyse de cytométrie de masse. Les méthodes décrites ici aideront l'utilisateur à éviter les pièges courants et obtenir des résultats cohérents en réduisant au minimum la variabilité, qui peut conduire à des données inexactes. Pour éclairer la conception expérimentale, la raison d'être des étapes facultatives ou alternatives dans le protocole et leur efficacité dans la découverte de nouvelles découvertes dans la biologie du système étudié est couvert. Enfin, des données représentatives sont présentées pour illustrer les résultats attendus des techniques presented ici.

Introduction

Cytometry permet la mesure simultanée de plusieurs cibles d'anticorps au niveau de la cellule unique sur de grandes populations de cellules. En cytométrie de flux à base de fluorescence classique, le nombre de paramètres qui peuvent être quantifiés est limitée par le chevauchement spectral entre le spectre d'émission de multiples fluorophores, ce qui nécessite des calculs de compensation de plus en plus complexes comme le nombre d'augmentations de paramètres. Ces limitations sont traitées par cytométrie de masse, où les anticorps conjugués à métaux lourds sont détectés et quantifiés par le temps de la spectrométrie de masse de vol (TOF) d'élargir considérablement le nombre de paramètres collectés en même temps et donner un profil de protéines d'abondance dimensionnelle élevée pour chaque cellule individuelle.

Une compréhension de base du fonctionnement de l'instrument de cytométrie de masse est bénéfique pour l'utilisateur et peut être essentielle pour le dépannage. Pour une description plus complète de mise au point et l'exécution d'une machine à cytométrie de masse,voir le manuscrit lié ^1. En bref, un échantillon de cellules est marqué avec un panel d'anticorps conjugués métalliques ciblant des marqueurs de surface cellulaire, des protéines cytoplasmiques, des protéines nucléaires, des protéines de la chromatine lié ou d' autres epitopes d'intérêt (figure 1i). Les cellules marquées sont chargés sur la machine, soit un à la fois par injection manuelle ou en utilisant un passeur d'échantillons que les échantillons à partir d'une plaque à 96 puits. Les cellules chargées sont injectés par l' intermédiaire d' un nébuliseur, qui génère une pulvérisation de gouttelettes de liquide d' encapsulation des cellules (Figure 1ii). Cette pulvérisation est positionnée de telle sorte que les cellules sont ionisés par une torche à plasma d'argon. Cette ionisation génère un nuage de particules comprenant tous les atomes constitutifs de chaque cellule (Figure 1iii). Comme ce nuage de particules se déplace vers le détecteur, les atomes de faible masse atomique sont séparés des ions de masse élevée par un filtre de masse quadripolaire. Les hauts ions de masse restants continuent au détecteur, où le abundance de chaque isotope est quantifiée (Figure 1IV). Les données brutes recueillies par le détecteur, sont analysés par le logiciel d'instruments de cytométrie de masse pour identifier les événements cellulaires. Pour chaque événement de cellule identifiée, le signal détecté dans chaque canal est quantifié et enregistré dans le fichier de sortie. Les canaux de masse utilisés pour détecter les anticorps conjugués métal lourd présentent un recouvrement spectral minimal, qui varie de 0,4% avec la plupart des contributions inférieures à 1%. En raison de ce faible diaphonie entre les canaux, il est généralement nécessaire de transformer les données avec une matrice de compensation avant l' analyse ^2. Cependant, il faut prendre soin lors de la conception du panneau expérimental d'anticorps pour assurer qu'un anticorps avec un épitope de haute abondance n'est pas affecté à un canal de masse qui contribue signal à un canal attribué à un anticorps à faible abondance, car cela pourrait créer une population artificiellement élevé dans le canal de réception de la contribution du signal.

<p class = "«" jove_content »> La préparation d'échantillons pour l'analyse de cytométrie de masse exacte dépend fortement des types d'échantillons recueillis et mis à l'essai l'hypothèse expérimentale. Nous fournissons des exemples de deux protocoles de récolte différents types de cellules (cellules souches embryonnaires humaines) et les cellules primaires (isolat de cellules épithéliales de la tumeur du sein de la souris). Lorsque vous commencez une étude de cytométrie de masse, il est conseillé de procéder d'abord à une petite expérience pilote pour faire en sorte que tous les protocoles et les anticorps à être utilisés fonctionnent bien entre les mains de l'enquêteur. Ceci est particulièrement essentiel lorsque les anticorps conjugués sont personnalisés pour être utilisés, comme la réaction de réduction partielle au cours de la conjugaison d'anticorps a le potentiel de perturber l'affinité des anticorps; Par conséquent, chaque anticorps personnalisé doit être validée de manière empirique pour assurer l'exactitude des données. D'autres considérations comprennent la détermination si des anticorps de surface cellulaire à utiliser dans l'essai reconnaîtra leurs épitopes après fixation ou si elles nited à appliquer à des cellules vivantes. Certains fixation peut empêcher la coloration appropriée avec des anticorps de surface cellulaire comme cela est connu pour se produire avec coloration peptide-CMH ^{3, 4.} Exécution d'une coloration d'anticorps de surface cellulaire sur des cellules vivantes peut être nécessaire pour certains anticorps, mais cela exclut la possibilité de barcoding avant le marquage de l' anticorps comme la plupart des méthodes de codes – barres sont effectuées après fixation ⁵ , bien que le code à barres à base d' anticorps ^{6, 7} est une exception.

Lors de la détermination du nombre de cellules devant être préparé pour l'analyse, il est important de savoir que seule une fraction des cellules chargées sur la machine sera détecté et produire des données. Cette perte est principalement due à l'inefficacité lorsque le nébulisateur pulvérise l'échantillon à la torche. La perte exacte pour cent dépend de la masse configuration de la machine cytométrie et le type cellulaire, mais peut varier 50-85% et devrait êtreconsidéré lors de la conception de l'expérience. Ce protocole a été optimisé pour 2×10 ⁶ cellules par échantillon , mais peut être adapté pour le traitement des petites ou plus grandes tailles d'échantillon. Ce protocole peut être utilisé avec des modifications minimes pour la taille des échantillons de 1 x 10 ⁶ 4 x 10 ^6, mais il est essentiel que la taille de l' échantillon soit maintenu au sein d' une expérience cohérente. Les modifications du nombre de cellules peuvent affecter l'intensité de la coloration des anticorps et Code à barres et doivent être conservés à peu près cohérente à travers à être directement comparés échantillons.

Certaines procédures, telles que l'étiquetage des cellules mortes et l'étiquetage de l'ADN, doivent être effectuées dans la grande majorité, sinon tous les modèles expérimentaux. Le marquage des cellules mortes dans des expériences analysant uniquement les marqueurs de surface peut être réalisée à l'aide Rh103, mais Rh103 doit être évitée pour des expériences où perméabilisation est nécessaire, car il entraîne une perte de coloration. Pour les expériences impliquant perméabilisation, il est conseillé d'utiliser le cisplatine <sup class = « xref »> 8 et, lorsque cela est possible, un anticorps reconnaissant la PARP clivée ou clivé Caspase pour détecter des cellules apoptotiques et mortes.

Code – barres échantillons peuvent réduire la consommation d'anticorps, diminuer le temps d'acquisition et d' éliminer la variabilité échantillon à échantillon ^9. Le procédé de codage à barres consiste à appliquer un code unique spécifique à l'échantillon à toutes les cellules, ce qui permet d'affecter chaque cellule à son échantillon d'origine. Après barcoding les échantillons peuvent être mis en commun avant la coloration d'anticorps, un processus qui assure que tous les échantillons sont colorés de manière égale. Pour minimiser l'erreur expérimentale, il est prudent de code à barres et des échantillons piscine qui doivent être directement comparés les uns aux autres. À l' heure actuelle , il existe plusieurs méthodes pour les échantillons barcoding pour l' analyse de cytométrie de masse ^{5, 6, 7,} dont deux sont présentées ici (voir ci – dessous).

Avec Reagen actuellement disponiblets , il est possible de quantifier l'abondance de 38 cibles d'anticorps, identifier des cellules en phase S ^10, distinguer les cellules vivantes et mortes ⁸ et de mesurer les niveaux cellulaires de ¹¹ l' hypoxie dans une expérience multiplexé d'échantillons multiples. Cette capacité à recueillir des données sur une seule cellule de haute paramètres pour les grandes populations de cellules permet une amélioration du profil des populations de cellules très hétérogènes et a déjà produit un certain nombre de nouvelles connaissances biologiques ^{12, 13, 14, 15, 16.} Les données complexes distillant résultant des informations interprétable a nécessité l'utilisation d'algorithmes de calcul , y compris Spanning Tree Progression de la densité des événements Normalisé (SPADE) ¹⁷ et ¹⁸ Visne.

Cet article présente un accèsaperçu de la façon de concevoir et de réaliser une masse cytométrie expérience et présente une analyse de base de données de cytométrie de masse.

Protocol

1. Récolte de cellules Récolte des cellules provenant d'un tissu primaire NOTE: Le procédé décrit pour la récolte de cellules à partir du tissu primaire est spécifiquement applicable aux tissus de tumeur du sein de la souris et peut ne pas être applicable est de tissus primaires provenant d'autres sources. Préparer le tampon de digestion en dissolvant 5 mg de hyaluronidase et 30 mg de collagénase dans 10 ml de milieu DMEM / …

Representative Results

Le protocole présenté ici peut être largement appliquée à une grande variété d'échantillons de cellules en culture et primaire avec seulement quelques modifications mineures. En fonction des besoins de l'expérience, elle peut être réalisée de manière modulaire lorsque certains éléments, tels que la coloration surface cellulaire ou le codage à barres, ne sont pas nécessaires. Utilisé dans son intégralité ce protocole permet la préparation de la masse multiplex…

Discussion

Le protocole présenté ici a été utilisé avec succès pour le traitement de diverses lignées cellulaires en culture (H1 et H9 CSEh, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) et des échantillons de tissus primaires (moelle osseuse de la souris, la souris foie embryonnaire, adultes de souris foie, une tumeur de la souris). Quelle que soit la source, tout tissu qui peut être dissociées en cellules individuelles tout en préservant l'état cellulaire devrait être prête à l'analyse par cytométrie de masse…

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239