जन Cytometry विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करना
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
जन cytometry भारी धातु लेबल, एक दृष्टिकोण है कि बहुत अच्छी तरह से क्या पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित फ्लो के साथ संभव है परे मानकों और गहरे विश्लेषण के लिए अवसरों की संख्या बढ़ गई है के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का इस्तेमाल करता है। किसी भी नई तकनीक की तरह ही, महत्वपूर्ण चरण हैं, जो मदद उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की विश्वसनीय पीढ़ी सुनिश्चित कर रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि बड़े पैमाने cytometry विश्लेषण के लिए सेल के नमूने के प्रसंस्करण के लिए कई तकनीकों को शामिल किया गया है। तरीकों यहाँ वर्णित में मदद मिलेगी उपयोगकर्ता सामान्य कठिनाइयों से बचने और परिवर्तनशीलता है, जो गलत डेटा को जन्म दे सकता कम करके संगत परिणाम प्राप्त। प्रयोगात्मक डिजाइन को सूचित करने के लिए, प्रोटोकॉल और सिस्टम जांच की जा रही के जीव विज्ञान में नए निष्कर्ष को उजागर करने में उनकी प्रभावोत्पादकता में वैकल्पिक या वैकल्पिक कदम के पीछे के तर्क कवर किया जाता है। अन्त में, प्रतिनिधि डेटा तकनीक presente से उम्मीद परिणाम वर्णन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता हैयहाँ d।
Introduction
Cytometry कोशिकाओं की विशाल जनसंख्या में एक एकल कोशिका स्तर पर अनेक एंटीबॉडी लक्ष्यों के एक साथ माप सक्षम बनाता है। पारंपरिक प्रतिदीप्ति आधारित फ्लो में, पैरामीटर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है की संख्या कई fluorophores के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है, जो मानकों की संख्या बढ़ जाती के रूप में जटिल मुआवजा गणना की आवश्यकता के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप द्वारा सीमित है। ये सीमाएं जन cytometry, जहां भारी धातु-संयुग्मित एंटीबॉडी का पता चला और उड़ान (टीओएफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री के समय बहुत एक साथ एकत्र पैरामीटर की संख्या का विस्तार करने और प्रत्येक व्यक्ति के सेल के लिए एक उच्च आयामी प्रोटीन बहुतायत प्रोफ़ाइल उपज द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं ने संबोधित कर रहे हैं।
साधन cytometry जन के कामकाज का एक बुनियादी समझ उपयोगकर्ता के लिए फायदेमंद है और समस्या निवारण के लिए आवश्यक हो सकता है। ट्यूनिंग की एक अधिक गहन विवरण और एक बड़े पैमाने पर cytometry मशीन को चलाने के लिए,संबंधित पांडुलिपि 1 देखें। संक्षेप में, एक सेल नमूना धातु संयुग्मित कोशिका की सतह मार्करों, cytoplasmic प्रोटीन, परमाणु प्रोटीन, क्रोमेटिन बाध्य प्रोटीन या ब्याज (चित्रा 1 मैं) के अन्य एपीटोपों को लक्षित एंटीबॉडी के एक पैनल के साथ लेबल है। लेबल कोशिकाओं एक autosampler का उपयोग कर मैनुअल इंजेक्शन द्वारा एक समय में एक मशीन पर भरी हुई है, या तो या कर रहे हैं कि एक 96 अच्छी तरह से थाली से नमूने हैं। लोड कोशिकाओं नेब्युलाइज़र, जो कोशिकाओं (चित्रा 1ii) encapsulating तरल बूंदों की एक स्प्रे उत्पन्न करता है के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता। इस स्प्रे तैनात ताकि कोशिकाओं एक आर्गन प्लाज्मा मशाल द्वारा आयनित कर रहे हैं। यह आयनीकरण एक कण बादल प्रत्येक कक्ष (चित्रा 1iii) के सभी संघटक परमाणुओं के शामिल उत्पन्न करता है। इस कण बादल डिटेक्टर के लिए यात्रा के रूप में, कम परमाणु भार परमाणुओं एक quadrupole मास फिल्टर द्वारा उच्च द्रव्यमान आयनों से अलग होती है। शेष उच्च द्रव्यमान आयनों डिटेक्टर, जहां abund के लिए जारीप्रत्येक आइसोटोप की मंजूरी मात्रा निर्धारित है (चित्रा 1iv)। डिटेक्टर द्वारा एकत्र कच्चे डेटा, जन cytometry साधन सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया जाता है सेल की घटनाओं की पहचान। प्रत्येक पहचान सेल घटना के लिए, संकेत प्रत्येक चैनल में पाया मात्रा निर्धारित और एक आउटपुट .fcs फाइल करने के लिए सहेजा जाता है। बड़े पैमाने पर भारी धातु संयुग्मित एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया चैनलों न्यूनतम वर्णक्रमीय ओवरलैप है, जो 1% से नीचे सबसे योगदान के साथ 0-4% से पर्वतमाला दिखा रहे हैं। चैनलों के बीच इस कम पार बात के कारण, यह आम तौर पर विश्लेषण 2 से पहले एक मुआवजा मैट्रिक्स के साथ डेटा को बदलने के लिए अनावश्यक है। हालांकि, ध्यान एंटीबॉडी के प्रयोगात्मक पैनल के डिजाइन के दौरान यह सुनिश्चित करें कि एक उच्च बहुतायत एपीटोप के साथ एक एंटीबॉडी एक जन चैनल है कि एक चैनल एक कम बहुतायत एंटीबॉडी करने के लिए आवंटित करने के लिए संकेत योगदान देता है करने के लिए आवंटित नहीं है, यह मई के रूप में लिया जाना चाहिए चैनल संकेत योगदान प्राप्त करने में एक कृत्रिम रूप से उच्च जनसंख्या पैदा करते हैं।
<p clगधा = "jove_content"> cytometry विश्लेषण जन के लिए नमूनों की सटीक तैयारी नमूने के प्रकार पर निर्भर एकत्र किया जा रहा है और प्रयोगात्मक परिकल्पना परीक्षण किया जा रहा। हम (मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं) कोशिकाओं के विभिन्न प्रकारों और प्राथमिक कोशिकाओं (माउस स्तन ट्यूमर उपकला कोशिका अलग) की कटाई के लिए दो प्रोटोकॉल के उदाहरण प्रदान करते हैं। जब एक जन cytometry अध्ययन शुरू, यह पहले एक छोटे से पायलट प्रयोग को पूरा करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी अन्वेषक के हाथ में अच्छी तरह से काम कर रहे हैं उपयोग किया जा करने के लिए सलाह दी जाती है। यह विशेष रूप से आवश्यक है जब कस्टम संयुग्मित एंटीबॉडी प्रयोग की जाने वाली कर रहे हैं, एंटीबॉडी संयुग्मन दौरान आंशिक कमी प्रतिक्रिया के रूप में संभावित एंटीबॉडी आत्मीयता बाधित करने के लिए है; इसलिए, प्रत्येक कस्टम एंटीबॉडी मूल रूप से वैद्य जा करने के लिए डेटा सटीकता सुनिश्चित करने की जरूरत है। अन्य विचार का निर्धारण शामिल कोशिका की सतह एंटीबॉडी परख में इस्तेमाल किया जा सकता है अगर निर्धारण के बाद उनके एपीटोपों पहचान लेंगे या अगर वे neएड कोशिकाओं रहने के लिए लागू किया जाना है। कुछ निर्धारण कोशिका की सतह एंटीबॉडी के साथ उचित धुंधला रोक सकता है के रूप में पेप्टाइड MHC धुंधला 3, 4 के साथ होने के लिए जाना जाता है। जीवित कोशिकाओं पर कोशिका की सतह एंटीबॉडी धुंधला करने में कुछ एंटीबॉडी के लिए आवश्यक हो सकता है, लेकिन इस एंटीबॉडी लेबलिंग से पहले बारकोडिंग के रूप में सबसे बारकोडिंग तरीकों निर्धारण 5 के बाद प्रदर्शन कर रहे हैं, हालांकि एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग 6, 7 एक अपवाद है का विकल्प निवारण होता है।कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण करने के विश्लेषण के लिए तैयार रहने की है, यह जानते हैं कि केवल कोशिकाओं मशीन पर लोड का एक अंश पता लगाया जाएगा और डेटा का निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस नुकसान जब कणित्र मशाल पर नमूना स्प्रे मुख्य रूप से अक्षमताओं के कारण है। सटीक प्रतिशत नुकसान मशीन सेटअप और कोशिका प्रकार लेकिन cytometry जन पर निर्भर करता है 50-85% से लेकर कर सकते हैं और होना चाहिएमाना जाता है जब प्रयोग डिजाइनिंग। यह प्रोटोकॉल नमूना प्रति 2×10 6 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन छोटा या बड़ा नमूना आकार के प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित किया जा सकता। यह प्रोटोकॉल न्यूनतम संशोधनों के साथ, 4 x 10 6 के लिए 1 एक्स 10 6 से नमूना आकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि नमूने का आकार एक प्रयोग के भीतर लगातार रखा जाना। सेल नंबर में परिवर्तन बारकोडिंग और एंटीबॉडी धुंधला की तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं और मोटे तौर पर लगातार रखा जाना चाहिए भर में सीधे तुलना करने के लिए नमूने हैं।
इस तरह के मृत सेल लेबलिंग और डीएनए लेबलिंग के रूप में कुछ प्रक्रियाओं, नहीं तो सब प्रयोगात्मक डिजाइन, विशाल बहुमत में बाहर किया जाना चाहिए। केवल सतह मार्कर का विश्लेषण करने के प्रयोगों में मृत कोशिकाओं की लेबलिंग Rh103 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन Rh103 प्रयोगों जहां permeabilization के लिए आवश्यक है के रूप में यह धुंधला नुकसान में परिणाम के लिए बचा जाना चाहिए। permeabilization से जुड़े प्रयोगों के लिए, यह सिस्प्लैटिन का उपयोग करने की सलाह दी जाती है <sऊपर वर्ग = "xref"> 8 और जब संभव हो, एक एंटीबॉडी cleaved PARP या cleaved कस्पासे पहचानने अपोप्तोटिक और मृत कोशिकाओं का पता लगाने के।
बारकोडिंग के नमूने, एंटीबॉडी की खपत को कम अधिग्रहण के समय में कमी और समाप्त कर सकते हैं नमूना करने के लिए नमूना परिवर्तनशीलता 9। बारकोडिंग की प्रक्रिया सभी कोशिकाओं है, जो अपनी उत्पत्ति के नमूने के प्रत्येक कक्ष आवंटित करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए एक अनूठा नमूना-विशिष्ट कोड लागू करना शामिल है। नमूने बारकोडिंग के बाद एंटीबॉडी धुंधला, एक प्रक्रिया है कि यह सुनिश्चित करता है सभी नमूनों समान रूप से दाग हैं करने से पहले जमा किया जा सकता है। प्रयोगात्मक त्रुटि को कम करने के लिए, यह बारकोड समझदारी है और किसी भी नमूने है कि सीधे एक दूसरे की तुलना में किया जाना है पूल। इस समय वहाँ विश्लेषण 5, 6, 7, जिनमें से दो यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं (देखें नीचे) cytometry जन के लिए नमूने बारकोडिंग के लिए कई तरीके मौजूद हैं।
वर्तमान में उपलब्ध reagen के साथयह 38 एंटीबॉडी लक्ष्य की बहुतायत मात्रा ठहराना एस चरण 10 में कोशिकाओं की पहचान, लाइव और मृत कोशिकाओं को अलग 8 और कई नमूनों की एक मल्टिप्लेक्स प्रयोग में हाइपोक्सिया 11 के सेलुलर स्तर को मापने के लिए संभव है टीएस। इस बड़े सेल आबादी के लिए उच्च पैरामीटर एकल कक्ष डेटा एकत्र करने की क्षमता बेहद विषम सेल आबादी के सुधार की रूपरेखा सक्षम बनाता है और पहले से ही उपन्यास जैविक अंतर्दृष्टि 12, 13, 14, 15, 16 के एक नंबर का उत्पादन किया गया। व्याख्या जानकारी के परिणामस्वरूप जटिल डेटा आसवन घनत्व सामान्यीकृत घटनाक्रम स्पैनिंग ट्री प्रगति (स्पेड) 17 और viSNE 18 सहित कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम के उपयोग की आवश्यकता है।
यह लेख एक सुलभ प्रस्तुत करता हैकैसे का अवलोकन डिजाइन और प्रयोग cytometry एक जन बाहर ले जाने और cytometry डेटा द्रव्यमान का बुनियादी विश्लेषण का परिचय करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विभिन्न सुसंस्कृत सेल लाइनों (एच 1 और H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) और प्राथमिक ऊतक के नमूने (माउस अस्थि मज्जा, माउस भ्रूण जिगर, माउस वयस्क के प्रसंस्करण के लिए नियोजित किया ग…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
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