Preparazione del campione per l'analisi di massa Citometria

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Massa utilizza citometria anticorpi coniugati con le etichette di metalli pesanti, un approccio che ha notevolmente aumentato il numero di parametri e opportunità per l'analisi pozzo profondo di quanto sia possibile con i tradizionali flusso basato sulla fluorescenza citometria. Come per ogni nuova tecnologia, ci sono passaggi critici che aiutano a garantire la generazione affidabile di dati di alta qualità. Qui presentata è un protocollo ottimizzato che comprende molteplici tecniche per il trattamento di campioni di cellule per l'analisi di citometria di massa. I metodi descritti qui aiuterà l'utente a evitare problemi comuni e raggiungere risultati coerenti minimizzando variabilità, che può portare a dati accurati. Per informare disegno sperimentale, la logica alla base operazioni opzionali o alternative nel protocollo e la loro efficacia nello scoprire nuove scoperte nella biologia del sistema oggetto di indagine è coperto. Infine, i dati rappresentativi è presentato per illustrare i risultati attesi dalle tecniche Presented qui.

Introduction

Citometria consente la misurazione simultanea di più target anticorpali a livello di singola cellula attraverso grandi popolazioni di cellule. Nel tradizionale citometria di flusso basato sulla fluorescenza, il numero di parametri che possono essere quantificate è limitato dalla sovrapposizione spettrale tra lo spettro di emissione dei fluorofori multipli, che richiede calcoli di compensazione sempre più complessi come il numero di parametri aumenta. Queste limitazioni sono rivolte in massa citometria, dove vengono rilevati e quantificati mediante tempo di volo (TOF) spettrometria di massa per espandere notevolmente il numero di parametri raccolti simultaneamente e produrre un alto dimensionale profilo proteico-abbondanza per ogni singola cella anticorpi metallo coniugati pesanti.

Una conoscenza di base del funzionamento della massa citometria strumento è vantaggioso per l'utente e può essere essenziale per la risoluzione dei problemi. Per una descrizione più approfondita di messa a punto e l'esecuzione di una macchina citometria di massa,consultare il relativo manoscritto ^1. Brevemente, un campione di cellule è etichettato con un pannello di metallo anticorpi coniugati destinati marcatori di superficie cellulare, le proteine citoplasmatiche, proteine nucleari, proteine cromatina-bound o altri epitopi di interesse (Figura 1i). Le cellule marcate vengono caricate sulla macchina, uno alla volta mediante iniezione manuale o mediante un autocampionatore che i campioni da una piastra a 96 pozzetti. Le cellule caricate vengono iniettate attraverso un nebulizzatore, che genera uno spruzzo di goccioline di liquido che incapsulano le cellule (Figura 1ii). Questo spray è posizionato in modo che le cellule vengono ionizzati da una torcia al plasma di argon. Questo ionizzazione genera una nube di particelle comprendente tutti gli atomi costituenti ciascuna cella (Figura 1iii). Poiché questa nube particella viaggia verso il rivelatore, bassi atomi di massa atomica sono separati dalle alte ioni massa da un filtro di massa a quadrupolo. I restanti alti ioni di massa continuano al rivelatore, dove l'abundance di ciascun isotopo viene quantificato (Figura 1iv). I dati grezzi raccolti dal rivelatore, vengono analizzati dal software dello strumento citometria di massa per identificare gli eventi cellulari. Per ciascun evento cella identificata, il segnale rilevato in ciascun canale viene quantificata e salvata in un file un'uscita .fcs. I canali di massa utilizzati per rilevare gli anticorpi metallo pesante coniugati presentano minima sovrapposizione spettrale, che va da 0,4% con la maggior parte dei contributi inferiori all'1%. A causa di questa cross-talk tra i canali, è generalmente necessario trasformare i dati con una matrice di compensazione prima dell'analisi ^2. Tuttavia, occorre prestare attenzione durante la progettazione del pannello sperimentale di anticorpi per garantire che un anticorpo con un epitopo alta abbondanza non è assegnato a un canale di massa che contribuisce segnale ad un canale assegnato ad un anticorpo a bassa abbondanza, in quanto ciò può creare artificialmente elevati della popolazione nel canale di ricezione del segnale del contributo.

<p class = "jove_content"> La preparazione esatta di campioni per analisi di citometria di massa dipende fortemente i tipi di campioni che vengono raccolti e l'ipotesi sperimentale in fase di test. Forniamo esempi di due protocolli per la raccolta diversi tipi di cellule (cellule staminali embrionali umane) e cellule primarie (topo tumore mammario isolare cellule epiteliali). Quando si inizia uno studio citometria di massa, si consiglia di effettuare prima un piccolo esperimento pilota per garantire che tutti i protocolli e gli anticorpi per essere utilizzati stanno lavorando bene nelle mani del ricercatore. Questo è particolarmente importante quando devono essere utilizzati anticorpi coniugati personalizzati, come la reazione di riduzione parziale durante la coniugazione anticorpo ha il potenziale di distruggere affinità anticorpale; Pertanto, ogni anticorpo personalizzato deve essere convalidata empiricamente per assicurare l'accuratezza dei dati. Altre considerazioni includono la determinazione se gli anticorpi superficie cellulare da utilizzare nel saggio riconoscerà loro epitopi dopo fissazione o se NEEd da applicare per vivere le cellule. Alcuni fissaggio può impedire il corretto colorazione con anticorpi superficie cellulare come noto verifica con peptide-MHC colorazione ^{3, 4.} Esecuzione di superficie cellulare colorazione anticorpale su cellule vive può essere necessario per alcuni anticorpi, ma esclude la possibilità di codici a barre prima dell'etichettatura anticorpo come maggior parte dei metodi di codici a barre vengono eseguiti dopo fissazione ⁵ sebbene codici a barre a base di anticorpi ^{6, 7} è un'eccezione.

Nel determinare il numero di cellule da preparare per l'analisi, è importante sapere che solo una frazione delle cellule caricate sulla macchina sarà rilevato e produrre dati. Questa perdita è dovuta in primo luogo a inefficienze quando il nebulizzatore spray campione al cannello. La perdita percentuale esatta dipende dalla massa citometria configurazione della macchina e tipo cellulare, ma può variare da 50-85% e deve essereconsiderati quando si progetta l'esperimento. Questo protocollo è stato ottimizzato per 2×10 ⁶ cellule per campione, ma può essere adatta a lavorare campioni di dimensioni più piccole o più grandi. Questo protocollo può essere utilizzato con minime modifiche per dimensioni del campione da 1 x 10 ⁶ a 4 x 10 ^6, tuttavia è fondamentale che la dimensione del campione essere mantenuta costante in un esperimento. Cambiamenti nel numero di cellule possono influenzare l'intensità dei codici a barre e colorazione degli anticorpi ed essere comunque ridotti all'incirca costante attraverso campioni da confrontare direttamente.

Alcune procedure, come l'etichettatura di cellule morte e l'etichettatura del DNA, devono essere effettuate nella stragrande maggioranza, se non tutti i disegni sperimentali. L'etichettatura di cellule morte in esperimenti analizzare solo marcatori di superficie può essere ottenuta utilizzando Rh103, ma Rh103 dovrebbe essere evitato per esperimenti in cui è richiesta permeabilizzazione come si verifica una perdita di colorazione. Per gli esperimenti che coinvolgono permeabilizzazione, si consiglia di utilizzare cisplatino <sup class = "xref"> 8 e, quando possibile, un anticorpo che riconosce PARP sfaldati o spaccati caspasi per rilevare le cellule apoptotiche e morti.

Campioni codici a barre possono ridurre il consumo di anticorpi, ridurre il tempo di acquisizione ed eliminare campione a campione variabilità ^9. Il processo di barcoding comporta l'applicazione di un codice specifico di esempio unico per tutte le celle, che viene utilizzato per assegnare ogni cella per il campione di origine. Dopo barcoding i campioni possono essere riuniti prima della colorazione anticorpale, un processo che assicura tutti i campioni sono macchiati ugualmente. Per ridurre al minimo errore sperimentale, è prudente codice a barre e piscina i campioni che devono essere direttamente confrontate tra di loro. Attualmente esistono diversi metodi per codici a barre dei campioni per l'analisi di citometria di massa ^{5, 6, 7,} due dei quali sono qui presentati (vedi sotto).

Con Reagen attualmente disponibilits è possibile quantificare l'abbondanza di 38 bersagli degli anticorpi, identificare le cellule in fase S ^10, distinguere le cellule vive e morte ⁸ e misurare i livelli cellulari di ipossia ¹¹ in un esperimento multiplex di campioni multipli. Questa capacità di raccogliere dati monocellulari alta parametro per grandi popolazioni cellulari consente una migliore profilatura di popolazioni cellulari altamente eterogenee e ha già prodotto una serie di dati biologici nuovi ^{12, 13, 14, 15, 16.} Distillando i dati complesso risultante per informazioni interpretabili ha richiesto l'uso di algoritmi di calcolo includendo Spanning Tree progressione della densità Eventi normalizzati (SPADE) ¹⁷ e ¹⁸ viSNE.

Questo articolo presenta una accessibilipanoramica di come progettare e realizzare una massa citometria esperimento e introduce analisi di base della massa citometria dati.

Protocol

1. cellule da raccolta Che raccolgono le cellule da tessuto primario NOTA: Il procedimento descritto per le cellule raccolta da tessuto primario è specificamente applicabile al tessuto tumorale mammario mouse e non può essere applicato come ai tessuti primari da altre fonti. Preparare tampone di digestione sciogliendo 5 mg e 30 mg ialuronidasi collagenasi in 10 ml DMEM / F12 supporti per grammo di tessuto da trattare. Filtrata sterilizzare tampone di digestione. Is…

Representative Results

Il protocollo presentato qui può essere ampiamente applicata ad una vasta gamma di campioni di cellule in coltura e primario con modifiche solo minori. A seconda delle esigenze dell'esperimento, può essere eseguita in modo modulare quando alcuni elementi, come codici a barre o superficie cellulare colorazione, non sono necessarie. Utilizzato nella sua interezza questo protocollo consente la preparazione di massa multiplato citometria campioni etichettati per identificazione popolaz…

Discussion

Il protocollo presentato qui è stato impiegato con successo per il trattamento di varie linee in coltura di cellule (H1 e H9 hESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e campioni di tessuti primari (midollo osseo di topo, il mouse del fegato embrionale, il mouse per adulti fegato, tumore mouse). Indipendentemente dalla fonte, qualsiasi tessuto che può essere dissociato in singole cellule preservando lo stato cellulare dovrebbe essere suscettibile di analisi mediante citometria di massa, ma può richiedere alcuni …

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239