質量サイトメトリー分析のための試料調製
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
質量サイトメトリーは、重金属標識とコンジュゲートした抗体、大幅に良く従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーを用いて可能であるものを超えて深い分析のためのパラメータと機会の数を増加させたアプローチを利用します。すべての新しい技術と同様に、高品質、信頼性の高いデータの生成を確保するための重要なステップがあります。ここに提示質量サイトメトリー分析のための細胞試料を処理するための複数の技術を組み込んで最適化されたプロトコルです。ここで説明する方法は、ユーザーが一般的な落とし穴を回避し、不正確なデータにつながる可能性の変動を、最小限に抑えることにより、一貫性のある結果を達成するのに役立ちます。実験計画を通知するために、プロトコルと調査されているシステムの生物学に新たな知見を暴くにおけるそれらの効果でオプションまたは代替の手順の理論的根拠が覆われています。最後に、代表的なデータは、技術のpresenteから予想される結果を説明するために提示されていますここでdは。
Introduction
フローサイトメトリーは、細胞の大集団を横切る単一細胞レベルでの複数の標的抗体の同時測定を可能にします。従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーでは、定量化可能なパラメータの数は、パラメータの数が増加するにつれてますます複雑補償計算を必要とする複数のフルオロフォアの発光スペクトルとの間のスペクトルの重なりによって制限されます。これらの制限は、重金属標識抗体が検出され、大幅に同時に収集するパラメータの数を拡張し、個々のセルのために高次元のタンパク質存在量プロファイルを生成するフライト（TOF）質量分析の時間によって定量化されているマスサイトメトリーによって対処されます。
器具サイトメトリー質量の仕組みの基本的な理解は、ユーザーにとって有益であり、トラブルシューティングのために不可欠であり得ます。より徹底したチューニングの説明とマスサイトメトリーのマシンを実行するために、関連の原稿1を参照してください。簡潔には、細胞試料は、細胞表面マーカー、細胞質タンパク質、核タンパク質、クロマチン結合タンパク質または目的の他のエピトープ（ 図1I）を標的と金属結合した抗体のパネルで標識されます。標識された細胞は、手動注射によって一度に一つまたはその96ウェルプレートからサンプルをオートサンプラーを使用してのいずれかで、機械にロードされています。ロードされた細胞は、細胞（ 図1II）を封入液滴のスプレーを生成する噴霧器を介して注入されます。細胞は、アルゴンプラズマトーチによってイオン化されるように、このスプレーは配置されています。このイオン化は、各セルを構成する全原子からなる粒子雲（ 図1iii）を生成します。この粒子雲が検出器に移動するように、低原子質量の原子は四重極質量フィルタによって高質量のイオンから分離されます。残りの高質量イオンは検出器、abundに進み各同位体のANCEは（ 図1iv）定量化されます。検出器によって収集された生データは、細胞イベントを識別するために、マスサイトメトリー機器ソフトウェアによって分析されます。識別された各セルのイベントのために、各チャネルで検出された信号を定量化して出力.fcsファイルに保存します。重金属結合した抗体を検出するための質量チャネルは1％以下、最も貢献して0から4パーセントの範囲で最小のスペクトルオーバーラップを示します。そのため、チャネル間のこの低クロストークのために、それは分析2の前に補償行列にデータを変換するために、一般的に不要です。しかし、注意は、この可能性があるため、高存在量のエピトープを有する抗体は、低存在量の抗体に割り当てられたチャネルに信号を寄与質量チャネルに割り当てられていないことを保証するために、抗体の実験パネルの設計時に注意すべきです信号寄与を受信チャンネルに人為的に高い人口を作成します。
<p cl尻="「jove_content」">サイトメトリー分析、質量のためのサンプルの正確な製造は、収集されるサンプルの種類に大きく依存する、実験仮説が試験されます。私たちは、異なる種類の細胞（ヒト胚性幹細胞）および初代細胞（マウス乳腺腫瘍上皮細胞の単離）を採取するための2つのプロトコルの例を提供しています。質量サイトメトリーの研究を始めたとき、最初に利用されるすべてのプロトコルおよび抗体は、研究者の手の中にうまく機能していることを確認するために、小さなパイロット実験を実施することをお勧めします。カスタム結合した抗体を使用するようにしているとき、これは抗体結合時の部分還元反応として抗体の親和性を破壊する可能性があり、特に不可欠です。そのため、各カスタム抗体は、データの正確性を保証するために、実験的に検証する必要があります。アッセイに使用する細胞表面の抗体が固定した後、または、彼らはNE場合はそれらのエピトープを認識する場合、他の考慮事項が決定することを含みますedは、細胞を生きて適用されます。ペプチドMHC染色3,4で発生することが知られているように、いくつかの固定は、細胞表面抗体と適切な染色を防止することができます。生細胞上の細胞表面抗体染色を実行するいくつかの抗体のために必要であるが、これは抗体ベースのバーコード6、7は例外であるが、ほとんどのバーコード法は固定5の後に実行される抗体標識の前にバーコード化のオプションを排除することができます。分析のために調製される細胞の数を決定するとき、マシンにロードされた細胞の画分のみが検出され、データを生成することを知ることが重要です。ネブライザーは、トーチでサンプルを噴霧するとき、この損失は、非効率性が主な要因です。正確なパーセント損失は50から85パーセントの範囲であることができる機械のセットアップおよび細胞型が、フローサイトメトリー質量に依存しなければなりません実験を設計する際に考慮しました。このプロトコルは、サンプルあたり2×10 6個の細胞のために最適化されているが、より小さいまたはより大きいサンプルサイズを処理するために適合させることができます。このプロトコルは、しかし、サンプルサイズが実験内一貫性が保たれることが重要であり、4×10 6、1×10 6からのサンプルサイズに対して最小の変更を加えて使用することができます。細胞数の変化は、バーコードおよび抗体染色の強度に影響を与えることができると直接比較されるべきサンプルを横切って概ね一貫性が保たれるべきです。
すべての実験デザインされていない場合、このような死んだ細胞標識およびDNA標識のようないくつかの手順は、、大多数で行われるべきです。唯一の表面マーカーを分析する実験における死細胞の標識はRh103を用いて達成することができるが、Rh103は、それは染色損失をもたらすよう透過が必要とされる実験のために避けるべきです。透過性を含む実験のために、シスプラチンを利用することをお勧めします<sクラスアップ=「外部参照」> 8と、可能性、アポトーシスおよび死細胞を検出するために、切断されたPARPまたは切断されたカスパーゼを認識する抗体。
バーコードのサンプルは、サンプル間の変動性を、抗体の消費を減らす取得時間を減少させ、除去することができる9。バーコードのプロセスは、その起源のサンプルに各セルを割り当てるために使用されている全ての細胞に固有のサンプル固有のコードを適用することを含みます。サンプルをバーコード化した後、抗体染色、すべてのサンプルを均等に染色されることを保証する工程の前にプールされてもよいです。実験誤差を最小にするために、それはバーコードに慎重であり、互いに直接比較される任意の試料をプールします。現在（下記参照）、ここで提示されているそのうちの2つ質量サイトメトリー分析5、6、7、のためのバーコードサンプルのいくつかの方法が存在します。
現在入手可能なreagen付きTSは、38個の抗体の標的の存在量を定量S期10で細胞を同定、生細胞と死細胞8を区別し、複数のサンプルの多重化実験における低酸素11の細胞レベルを測定することが可能です。大きな細胞集団のための高パラメーター単一細胞データを収集するこの能力は、非常に不均一な細胞集団の改善されたプロファイリングを可能にし、既に新規な生物学的洞察12、13、14、15、16の数を生産しています。解釈情報に得られた複素データを蒸留すると、スパニングツリー密度正規化イベントの進行（SPADE）17とviSNE 18を含む計算アルゴリズムの使用を必要としています。
この記事では、アクセスを提供します設計・マスサイトメトリー実験を実施する方法の概要とマスサイトメトリーデータの基本的な分析を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルが正常に様々な培養細胞株（H1及びH9 hESCを、たmESC、MCF7、HEK 293、KBM5、HMEC、MCF10A）および原発組織サンプル（マウス骨髄、マウス胎児肝臓、マウス成体の処理のために使用されています肝臓、マウス腫瘍）。関わらず、ソースの、細胞の状態を維持しながら、単一の細胞に解離させることができる任意の組織は、質量サイトメトリーにより解析に従順であるべき?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
References
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
