대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
질량은 세포 계측법 중금속 라벨, 잘 세포 계측법 기존의 형광 기반의 흐름을 가능한 것 이상으로 매개 변수와 깊은 분석을위한 기회의 수를 크게 증가하고있다 접근 방식으로 결합하는 항체를 사용합니다. 새로운 기술로서, 고품질 데이터의 안정적인 발전을 보장 중요한 단계가 있습니다. 질량 계측법 분석 세포 샘플의 처리를 위해 다수의 기술을 통합 최적화 프로토콜은 여기에 제시 하였다. 여기에 설명 된 방법은 사용자가 일반적인 실수를 방지하고 데이터의 부정확성을 초래할 수 변동을 최소화함으로써 일관된 결과를 달성 할 수 있도록한다. 실험 설계를 알리려면, 프로토콜 및 조사되고 시스템의 생물학의 새로운 연구 결과를 폭로에서의 효능에 옵션 또는 대체 단계 뒤에있는 근거가 덮여있다. 마지막으로, 대표 데이터는 기법 presente 예상 결과를 설명하기 위해 제시여기 거라고.
Introduction
세포 계측법은 세포의 큰 개체군에 걸쳐 단일 세포 수준에서 여러 항체 표적의 동시 측정을 가능하게한다. 전통적인 형광 계 유동 세포 계측법으로 정량화 될 수있는 매개 변수의 수는 파라미터의 수가 증가함에 따라 점점 더 복잡한 보정 계산을 필요로 여러 형광체의 발광 스펙트럼과 스펙트럼 오버랩에 의해 제한된다. 이러한 제한은 중금속 복합 항체가 검출 크게 동시에 수집 매개 변수의 수를 확장하고 각 셀의 고차원 단백질 풍부 프로파일을 수득 비행 (TOF) 질량 분석 시간 정량화 질량 계측법에 의해 다루어진다.
악기 세포 계측법 질량의 동작의 기본적인 이해는 사용자에게 유용 및 문제 해결에 필수적인 수 있습니다. 보다 철저한 튜닝의 설명과 대량 세포 계측법 기계를 실행하는 경우,관련 원고 1 참조. 간략하게, 세포 시료를 세포 표면 마커, 세포질 단백질, 핵 단백질, 염색질 – 결합 단백질 또는이자 (도 1I)의 다른 에피토프를 표적 금속 복합 항체의 패널로 라벨링된다. 표지 된 세포는 오토 샘플러를 사용하여 컴퓨터 상에 로딩이든 수동 주입하여 한 번에 하나되는 96- 웰 플레이트의 샘플. 로드 셀은 셀 (도 1II)를 봉입 액 적의 분무를 생성하는 분무기를 통해 주입된다. 세포를 아르곤 플라즈마 토치에 의해 이온화되도록이 스프레이가 배치된다. 이 이온화 각각의 셀 (도 1iii)의 모든 구성 원자 이루어진 입자 구름을 생성한다. 이 입자 구름 검출기로 이동함에 따라, 낮은 원자 질량 원자 사중 극 질량 필터에 의해 고 이온 질량 분리된다. 나머지 높은 질량 이온 검출기의 abund 계속각각의 동위 원소는 ANCE (도 1iv)를 정량화 하였다. 검출기에 의해 수집 된 원시 데이터는 세포 이벤트를 식별하기 위해 대량 세포 계측법 악기 소프트웨어에 의해 분석된다. 각각의 식별 된 셀의 경우, 각 채널에서 검출 된 신호는 수치화되어 출력 .fcs 파일에 저장. 중금속 접합 된 항체를 검출하기 위해 사용 된 질량 채널은 1 % 이하로 가장 기여 0-4 %의 범위를 최소한의 스펙트럼 중첩을 나타낸다. 이 때문에 채널 간의 낮은 누화, 분석 전에 2 보상 매트릭스로 데이터를 변환하는 것은 일반적으로 불필요하다. 그러나, 의료이 있으므로, 높은 풍부한 항원과 항체는 미량 항체에 할당 된 채널의 신호 기여 질량 채널에 할당되지 않는 것을 보장하는 항체의 실험 패널의 설계시주의해야 신호 기여를 수신하는 상기 채널에서의 인공 높은 인구를 생성한다.
<p cl엉덩이 = "jove_content"> 계측법 질량 분석 용 샘플의 정확한 제조 수집되는 샘플의 유형에 크게 의존하고 실험 가설이 테스트된다. 우리는 세포의 다른 유형 (인간 배아 줄기 세포) 및 일차 전지 (마우스 유방 종양 상피 세포의 분리)를 수확 두 프로토콜의 예를 제공합니다. 대량 세포 계측법 연구를 시작하면 먼저 모든 프로토콜과 항체가 연구자의 손에서 잘 작동 활용 될 수 있도록 작은 파일럿 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 맞춤 결합 항체가 사용되는 경우이 항체의 결합 중에 부분 환원 반응으로 항체 친 화성을 방해 할 가능성이 특히 중요하다; 따라서, 각각의 정의 된 항체는 데이터 정확성을 보장하기 위해 경험적으로 검증되어야한다. 그들은 NE 경우 세포 표면 항체 고정화 후에도 에피토프를 인식 분석에 사용하거나 할 경우 기타 고려 결정하는 단계를 포함에드 셀을 살고 적용 할 수 있습니다. 펩타이드는 MHC 3,4- 얼룩 발생하는 것으로 알려져 일부 고정 세포 표면 항체 적절한 착색을 방지 할 수있다. 생균의 세포 표면 항체 염색을 수행하면 어떤 항체 필요할 수 있지만,이 항체 기반 바코드 6,7 예외이지만 대부분 바코드 방법은 고정 5 이후에 수행되는 항체 라벨링 전에 바코드의 옵션을 배제 할 수있다.세포의 수를 결정하는 분석을 위해 준비 될 때, 컴퓨터에로드 셀의 일부만이 탐지된다는 것을 알고있는 데이터를 생성하는 것이 중요하다. 분무기 토치에서 시료를 분무 할 때의 손실은 효율성에 주로 기인한다. 정확한 퍼센트의 손실은 50~85%에 이르기까지 다양 기계 설치 및 세포 유형하지만 세포 계측법 질량에 의존하고 있어야한다실험을 설계 할 때 고려했다. 이 프로토콜은 샘플 당 2 × 106 세포에 최적화되어 있지만, 크거나 작은 샘플 크기를 처리하도록 구성 될 수있다. 이 프로토콜은 그러나 샘플 크기는 실험 내의 일관성 유지하는 것이 중요하고, 4 × 106 1 × 106에서 샘플의 크기에 대한 최소한의 변경으로 사용될 수있다. 세포 수의 변화는 바코드 및 항체 염색의 강도에 영향을 미칠 수있는 샘플을 직접 비교할 수 걸쳐 대략 일치 유지되어야한다.
모든 실험 설계되지 않은 경우 등의 죽은 세포 라벨 및 DNA 라벨과 같은 일부 절차는, 대부분에서 수행되어야한다. 오직 표면 마커 분석 실험 사균의 라벨링 Rh103를 사용하여 달성 될 수 있지만, Rh103는 염색의 손실 결과로서 permeabilization이 필요한 실험 피해야한다. permeabilization을 포함하는 실험의 경우, 시스플라틴 (cisplatin)을 사용하는 것이 좋습니다 <s클래스 = "외부 참조"> (8), 최대 가능하면 PARP 절단 또는 벽개 카스파을 인식하는 항체는 세포 사멸과 사균을 검출한다.
바코드 샘플은 항체 소비를 줄이기 획득 시간을 감소 및 제거 할 수있는 샘플 간 가변성 9. 바코드의 과정은 기원의 샘플로 각 셀을 할당하는 데 사용되는 모든 세포에 고유 한 예제 특정 코드를 적용하는 것을 포함한다. 샘플 바코드 항체 염색 후, 모든 샘플이 동일하게 보장 염색 처리 전에 풀링 될 수있다. 실험 오차를 최소화하기 위해서는 바코드에 신중하고 서로 직접 비교할 수있는 모든 샘플을 풀. 현재 (아래 참조) 여기서 제시되는 두 분석 5, 6, 7, 계측법 질량에 대한 샘플 바코드위한 여러 방법이 존재한다.
현재 reagen로38 개 항체 타겟 풍부 정량화 S 상 (10)에서 셀을 식별 라이브 사균 8 구별 복수 샘플들의 다중화 실험 저산소증 (11)의 세포 농도를 측정 할 수있다 화면 반전. 대형 세포 집단 높은 파라미터 단일 셀 데이터를 수집하는 능력은 매우 이종 세포 집단의 개선을 가능 프로파일 이미 신규 생물학적 통계 12, 13, 14, 15, 16의 숫자를 제작했다. 해석 가능한 정보로 생성 된 복소 데이터를 증류시켜 스패닝 트리 밀도 정규화 행사 진행 (SPADE) 17 및 18을 포함 viSNE 계산 알고리즘의 사용을 요구했다.
이 문서에 액세스를 제공합니다방법의 개요는 설계 및 실험 세포 계측법 질량을 수행하고 데이터 세포 계측법 대량의 기본적인 분석을 소개합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜이 성공적으로 다양한 배양 된 세포주 (H1 및 H9 hESCs는, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) 및 주 조직 샘플 (마우스 골수, 마우스 배아 간 마우스 성인의 처리를 위해 사용되어왔다 간, 마우스 종양). 관계없이 소스, 휴대 상태를 유지하면 세포 계측법 질량 분석 의무해야하지만, 어떤 프로토콜 최적화해야하는 동안 하나의 세포로 해리 될 수있는 조직. 몇 가지 항원이 사용되는 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
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