Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Masse cytometri benytter antistoffer konjugert med tungmetall etiketter, en tilnærming som har betydelig økt antall parametere og muligheter for dyp analyse langt utover hva som er mulig med konvensjonelle fluorescens-baserte strømningscytometri. Som med all ny teknologi, er det kritiske trinn som bidrar til å sikre pålitelig generasjon av høy kvalitet data. Presenteres her er en optimal protokoll som omfatter flere teknikker for gjenvinning av celleprøver for masse cytometri analyse. Metodene som er beskrevet her vil hjelpe brukeren unngå vanlige fallgruver og oppnå konsistente resultater ved å minimere variasjon, noe som kan føre til unøyaktige data. For å informere eksperimentell design, er begrunnelsen bak valgfrie eller alternative fremgangsmåten i protokollen og deres effekt i å avdekke nye funn i biologien til systemet som undersøkes dekket. Endelig er representative data presentert for å illustrere forventede resultater fra teknikker ented her.

Introduction

Cytometri muliggjør samtidig måling av flere antistoff-mål på et celle-nivå over store populasjoner av celler. I tradisjonell fluorescens-baserte strømningscytometri, er antallet av parametere som kan kvantifiseres begrenset av spektral overlapping mellom emisjonsspektret av flere fluoroforer, som krever stadig mer komplekse kompensasjons beregninger som antall parametre Øker. Disse begrensningene er adressert av masse cytometri, hvor tungmetall-konjugerte antistoffer blir detektert og kvantifisert ved flukttid (TOF) massespektrometri som utvider antall parametere innsamlet samtidig og gir en høy dimensjons protein-overflod profil for hver enkelt celle.

En grunnleggende forståelse av arbeidet i massen cytometri instrumentet er gunstig for brukeren og kan være avgjørende for feilsøking. For en mer grundig beskrivelse av tuning og kjører en masse cytometri maskin,se relaterte manuskriptet ^en. I korthet blir en celleprøve som er merket med et panel av metall-konjugerte antistoffer målrettet mot celleoverflatemarkører, cytoplasmatiske proteiner, kjerneproteiner, kromatin-bundne proteiner eller andre epitoper av interesse (figur 1i). De merkede celler blir lastet inn i maskinen, enten en av gangen ved manuell injeksjon eller ved hjelp av en automatisk prøvetaker som tar prøver fra en 96-brønns plate. De fylte celler blir injisert gjennom en forstøver, som frembringer en dusj av væskedråper som innkapsler cellene (figur 1ii). Denne sprayen er plassert slik at cellene blir ionisert av en argon-plasmabrenner. Denne ionisering genererer en partikkelskyen som består av alle de konstituerende atomene i hver celle (figur 1iii). Ettersom denne partikkel-sky reiser til detektoren, er lav atommasseenatomer adskilt fra de høye masseioner ved en kvadrupolmasse filter. De resterende høye masse ioner fortsette til detektoren, hvor abundance av hver isotop kvantifiseres (figur 1iv). De rå data som samles inn ved hjelp av detektoren, blir analysert ved hjelp av masse-cytometri instrumentet programvare for å identifisere cellearrangementer. For hver identifisert celle hendelse, blir det signal som detekteres i hver enkelt kanal kvantifisert og lagret til en utgang .fcs fil. Masse kanaler som brukes for å detektere tungmetall konjugerte antistoffer som utviser minimal spektral overlapping, som spenner 0-4% med de fleste bidrag under 1%. På grunn av denne lave krysstale mellom kanalene, er det vanligvis unødvendig å transformere dataene med en kompensering matrise før analyse ^2. Imidlertid bør man være forsiktig under utformingen av den eksperimentelle panel av antistoffer for å sikre at et antistoff med en høy-overflod epitopen ikke er tilordnet til en massekanal som bidrar signal til en kanal som er tilordnet en lav-overflod antistoff, da dette kan skape en kunstig høy populasjon i kanalen å motta signalet bidrag.

<p class = "jove_content"> Den eksakte fremstilling av prøver for masse cytometri analyse er sterkt avhengig av hvilke typer prøver ble samlet inn og den eksperimentelle hypotese som testes. Vi gir eksempler på to protokoller for høsting forskjellige typer celler (humane embryonale stamceller) og primære celler (musebrysttumor epitelcelle isolat). Når begynner en masse cytometri studie, er det tilrådelig å først gjennomføre en liten pilotforsøk for å sikre at alle protokoller og antistoffer for å bli utnyttet fungerer bra i etterforsker hender. Dette er spesielt viktig når tilpasset konjugert antistoffer som skal anvendes, som den partielle reduksjonsreaksjon under antistoffkonjugering har potensiale til å forstyrre antistoffaffinitetskromatografi; derfor må hver tilpasset antistoffet som skal valideres empirisk for å sikre datanøyaktighet. Andre betraktninger innbefatter bestemmelse hvis celleoverflate-antistoffene som skal anvendes i analysen vil kjenne deres epitoper etter fiksering, eller hvis de need å bli brukt til å leve celler. Noen fiksering kan hindre riktig farging med celleoverflate-antistoffer som er kjent for å forekomme sammen med peptid-MHC beising ^{3, 4.} Utføre celleoverflate-antistoff farging på levende celler kan være nødvendig for noen antistoffer, men dette utelukker muligheten for barcoding før antistoffmerking som de fleste strekkode metoder blir utført etter fiksering ⁵ selv om antistoff-baserte strekkoding ^{6, 7} er et unntak.

Ved bestemmelse av antallet celler som skal fremstilles for analyse, er det viktig å vite at bare en fraksjon av cellene anbringes på maskinen vil bli detektert og produsere data. Dette skyldes først og fremst til ineffektivitet når forstøveren sprays prøven ved brenneren. Den nøyaktige prosent tap er avhengig av den masse-cytometri maskinoppsettet og celletype, men kan ligge i området 50-85% og børvurderes ved utformingen av forsøket. Denne protokollen har blitt optimalisert for 2×10 ⁶ celler pr datautvalg, men kan tilpasses for behandling av mindre eller større prøvestørrelser. Denne protokollen kan anvendes med minimale modifikasjoner til prøvestørrelser fra 1 x 10 til 4 x ⁶ 10 ^6, men det er avgjørende at prøvestørrelsen holdes konsekvent innenfor et eksperiment. Endringer i celleantallet kan påvirke den intensitet av strekkoding og antistoff farging og bør holdes omtrent lik i de prøver som skal sammenlignes direkte.

Noen fremgangsmåter, så som døde cellemerking og DNA-merking, bør utføres i de aller fleste, om ikke alle eksperimentelle design. Merkingen av døde celler i forsøk å analysere kun overflatemarkører kan oppnås ved hjelp av Rh103, men Rh103 bør unngås for forsøk hvor permeabilisering er nødvendig fordi det resulterer i farging tap. For eksperimenter som involverer permeabilization, er det tilrådelig å bruke cisplatin <sopp class = "ekstern referanse"> 8 og, når det er mulig, et antistoff som gjenkjenner spaltet PARP eller spaltes Caspase å påvise apoptotiske og døde celler.

Strekkoding prøver kan redusere antistoff bruken, redusere innhentingstiden og eliminere sample-til-sample variabilitet ^9. Prosessen med strekkoding involverer å påføre en unik sample-spesifikk kode for alle celler, som brukes til å tildele hver enkelt celle til sin prøve av opprinnelse. Etter barcoding samplene kan samles før antistoffarging, en prosess som sikrer at alle prøvene er farget på samme måte. For å minimere eksperimentelle feil, er det klokt å strekkode og bassenget til alle prøver som skal sammenlignes direkte med hverandre. For tiden finnes det flere metoder for å barcoding prøver for masse cytometri analyse ^{5, 6, 7,} hvorav to er angitt her (se nedenfor).

Med tiden tilgjengelig Reagents Det er mulig å kvantifisere mengde av 38 antistoff-mål, identifisere celler i S-fase ^10, skille levende og døde celler ⁸ og måle cellulære nivåer av hypoksi ¹¹ i en multiplekset eksperiment av flere prøver. Denne evnen til å samle høy parameter enkelt celledata for store cellepopulasjoner muliggjør forbedret profil i heterogene cellepopulasjoner, og har allerede produsert en rekke nye biologiske innsikt ^{12, 13, 14, 15, 16.} Destillering det resulterende kompleks data til tolkbar informasjon har krevet bruk av beregningsalgoritmer blant annet omfatter tre Progresjon av tetthet normaliserte hendelser (SPADE) ¹⁷ og viSNE ^18.

Denne artikkelen presenterer en tilgjengeligoversikt over hvordan man skal utforme og gjennomføre en masse cytometri eksperiment og innfører grunnleggende analyse av masse cytometri data.

Protocol

1. Cell Høsting Innhøsting av celler fra primærvev MERK: Fremgangsmåten beskrevet for høsting av celler fra primærvev er spesielt anvendelig til musebrysttumorvevet, og vil kanskje ikke gjelde som er å primære vev fra andre kilder. Forbered nedbrytningsbuffer ved å oppløse 5 mg hyaluronidase og 30 mg kollagenase i 10 ml DMEM / F12-medium per gram av vevet som skal behandles. Filter sterilisere fordøyelsen buffer. Isoler primære brystkjerteltumor fra mus o…

Representative Results

Protokollen presentert her kan grovt anvendes på et bredt utvalg av dyrkede og primære celleprøver med bare mindre modifikasjoner. Avhengig av kravene til forsøket, kan den utføres på en modulær måte ved visse elementer, som for eksempel strekkoding eller celleoverflatefarging, er ikke nødvendig. Benyttes i sin helhet denne protokollen muliggjør fremstilling av tidsmultipleksede masse cytometri prøver merket for død celle utelukkelse, S-fase befolkning identifikasjon og farge…

Discussion

Protokollen som presenteres her er blitt anvendt for behandling av forskjellige dyrkede cellelinjer (H1 og H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) og prøvene primærvev (benmarg fra mus, mus embryonisk lever, mus voksen lever, musetumor). Uavhengig av kilden, en hvilken som helst vev som kan bli dissosiert til enkeltceller og samtidig bevare cellet tilstand skal være egnet for analyse ved hjelp av masse cytometri, men kan kreve noen optimalisering protokoll. Det er viktig å merke seg at noen epitoper som …

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239