Подготовка проб для анализа Масс-цитометрии

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Масс-цитометрии используют антитела, конъюгированные с тяжелыми металлами этикетки, подход, который значительно увеличилось число параметров и возможностей для глубокого анализа далеко за пределы того, что возможно с обычной флуоресценции на основе проточной цитометрии. Как и с любой новой технологией, есть важные шаги, которые помогают обеспечить надежное получение данных высокого качества. Представленные здесь является оптимизированным протокол, который включает в себя несколько методов для обработки образцов клеток для анализа масс цитометрии. Методы, описанные здесь, помогут пользователю избежать распространенных ошибок и добиться согласованных результатов путем минимизации изменчивости, что может привести к неточным данным. Сообщать экспериментальный дизайн, обоснование дополнительных или альтернативных шагов в протоколе и их эффективности в выявлении новых открытий в биологии исследуемой системы покрыто. Наконец, представительные данные представлены для иллюстрации ожидаемых результатов от Presente техникиd здесь.

Introduction

Цитометрии позволяет одновременное измерение нескольких целей антител на уровне одной клетки в больших популяциях клеток. В традиционной флуоресценции на основе проточной цитометрии, число параметров, которые могут быть определены количественно ограниченно спектральным перекрытием между спектром излучения нескольких флуорофоров, что требует все более и более сложных вычислений компенсации, как число параметров увеличиваются. Эти ограничения рассматриваются по массе цитометрии, где тяжелые металлы, конъюгированным антитела обнаружены и количественно по времени пролета (TOF) масс-спектрометрии, чтобы значительно расширить число параметров, собранных одновременно и дают высокую размерную профиль белка изобилие для каждой отдельной клетки.

Базовое понимание выработок массы цитометрии инструмента является полезным для пользователя и может иметь важное значение для поиска неисправностей. Для более подробного описания настройки и запуска массовой цитометрии машины,видеть связанные рукописи ^1. Если коротко, то образец клеток метят панелью конъюгированных антител металла , ориентированных на маркеры клеточной поверхности, цитоплазматические белки, ядерные белки, хроматин-связанные белки или другие эпитопы , представляющие интерес (рис 1i). Меченые клетки загружаются на машину, либо по одному времени с помощью ручной или инъекции с помощью пипетки, что образцы из 96-луночного планшета. Загруженные клетки инъецируют через распылитель, который генерирует струю капель жидкости , заключающей клетку (рис 1II). Этот спрей расположен таким образом, что клетки ионизируется аргоновой плазменной горелки. Эта ионизация создает облако частиц , состоящий из всех составляющих атомов каждого элемента (рис 1iii). Как это облако частиц движется к детектору, низкие атомные массовые атомы отделяются от высоких масс ионов с помощью масс-квадрупольного фильтра. Остальные высокие массовые ионы продолжают в детектор, где abundANCE каждого изотопа количественно (рис 1IV). Исходные данные, собранные с помощью детектора, анализирует с помощью цитометрии инструмента программного обеспечения для идентификации массового события клеток. Для каждого идентифицированного события клеток, сигнал обнаружен в каждом канале количественно и сохраняется в выходном файле .fcs. Массовые каналы, используемые для обнаружения тяжелого металла, конъюгированных антител обнаруживают минимальное спектральное перекрытие, которое колеблется от 0-4% с большинством взносов ниже 1%. Из – за этого низкие перекрестные помехи между каналами, то , как правило , нет необходимости , чтобы преобразовать данные с матрицей компенсации перед анализом ^2. Тем не менее, следует соблюдать осторожность при проектировании экспериментальной панели антител, чтобы гарантировать, что антитело с высокой численностью эпитопом не назначено массовым каналом, который вносит свой вклад сигнала канала, назначенный на низкую численность антитела, так как это может создать искусственно завышенные населения в канале, получающего вклад сигнала.

<p clосел = "«jove_content»"> Точная подготовка образцов для анализа массы цитометрии в значительной степени зависит от типов образцов, собираемых и экспериментальная гипотеза проходит испытания. Мы приводим примеры из двух протоколов для уборки различных типов клеток (эмбриональные стволовые клетки человека) и первичные клеток (опухоли молочной железы мышей эпителиальных клеток изолят). Когда начинает исследование массы цитометрии, целесообразно сначала провести небольшой эксперимент пилотного обеспечить, чтобы все протоколы и антитело, которые будут использоваться хорошо работают в руках следователя. Это особенно важно, когда должны быть использованы пользовательским конъюгированные антитела, в качестве частичной реакции восстановления во время конъюгации антитела имеет потенциал, чтобы разрушить аффинность антитела; Таким образом, каждый заказ антитело должно быть подтверждено эмпирически, чтобы обеспечить точность данных. Другие факторы включают в себя определение, если на клеточной поверхности антитела, используемые в анализе будет распознавать их эпитопы после фиксации или если они Н.Е.ред применяться для живых клеток. Некоторые фиксации может мешать нормальному окрашивание с антителами клеточной поверхности , как известно, происходит с пептид-МНС окрашивания ^{3, 4.} Выполнение окрашивания антител на клеточной поверхности на живые клетки могут быть необходимы для некоторых антител, но это исключает возможность Barcoding до маркировки антител , как большинство методов Barcoding выполняются после фиксации ⁵ , хотя штриховое кодирование антитела на основе ^{6, 7} является исключением.

При определении числа клеток, который должен быть подготовлен для анализа, важно знать, что только часть из клеток, нагруженных на машину будут обнаружены и выдавать данные. Эта потеря в первую очередь из-за неэффективности, когда распылитель разбрызгивает образец на факел. Точная потери процентов зависит от массы цитометрии установки машины и типа клеток, но может варьироваться от 50-85% и должна бытьучитывать при проектировании эксперимента. Этот протокол был оптимизирован для 2×10 ⁶ клеток на образец , но может быть приспособлен для обработки меньших или больших размеров выборки. Этот протокол может быть использован с минимальными изменениями для образцов размеров от 1 × 10 ⁶ до 4 × 10 ^6, однако очень важно , чтобы размер выборки быть последовательным в течение эксперимента. Изменения числа клеток могут влиять на интенсивность Barcoding и антител окрашивания и должны храниться примерно последовательно через образцы непосредственно сравнивать.

Некоторые процедуры, такие как мертвое мечение клеток и маркировка ДНК, следует проводить в подавляющем большинстве, если не во всех экспериментальных конструкциях. Маркировка мертвых клеток в экспериментах анализируя только поверхностные маркер может быть достигнута при использовании Rh103, но Rh103 следует избегать для экспериментов, где требуются пермеабилизации как это приводит к потере окрашивания. Для экспериментов с пермеабилизацией, рекомендуется использовать цисплатины <sдо класса = «» внешних ссылок> 8 и, когда это возможно, антитело , распознающее расщепляется PARP или расщепляется каспазы для обнаружения апоптоза и мертвые клетки.

Barcoding образцы могут уменьшить потребление антител, сократить время сбора и ликвидации выборки к выборке вариабельность ^9. Процесс штрихкодирования включает в себя применение уникального образца конкретного кода для всех ячеек, который используется, чтобы назначить каждую клетку его образец происхождения. После того, как Barcoding образцы могут быть объединены перед использованием меченых антител, процесс, который обеспечивает все образцы окрашивали в равной степени. Чтобы свести к минимуму ошибки эксперимента, благоразумно штрихкода и объединять любые образцы, которые должны быть непосредственно сопоставлены друг с другом. В настоящее время существует несколько способов Barcoding образцов для анализа массы цитометрии ^{5, 6, 7,} две из которых представлены здесь (см ниже).

С имеющимся в настоящее время ReageNт.с. можно количественно оценить обилие 38 мишеней антител, идентификации клеток в S-фазе ^10, различают живой и мертвые клетки ⁸ и измеряют клеточные уровни гипоксии ¹¹ в мультиплексном эксперименте нескольких образцов. Эта способность собирать данные одной ячейки высокого показателя для крупных клеточных популяций позволяет улучшить профилирование популяций сильно неоднородных клеточных и уже подготовила ряд новых биологических идей ^{12, 13, 14, 15, 16.} Перегонка в результате сложных данных в интерпретируемой информации требуется использование вычислительных алгоритмов , включая Spanning Tree Прогрессирование плотности нормированных событий (лопату) ¹⁷ и ¹⁸ viSNE.

В данной статье представлена ​​доступнаяОбзор того, как проектировать и проводить массу цитометрии эксперимента и представляет основной анализ массы цитометрии данных.

Protocol

1. Сбор клеток Сбора клеток из первичной ткани Примечание: Процесс, описанный для уборки клеток из первичной ткани специфический применимо к ткани опухоли молочной железы мыши и не может быть применимы как к первичным тканям из других источников. Приготовьте пищ…

Representative Results

Протокол, представленные здесь, могут найти широкое применение в самых различных культурных и первичных клеточных образцов с только незначительными изменениями. В зависимости от требований эксперимента, она может быть выполнена по модульному принципу, когда некото?…

Discussion

Протокол, представленные здесь, были успешно использованы для обработки различных культивируемых клеточных линий (H1 и H9 ЭСК, mESCs, MCF7, НЕК 293, KBM5, HMEC, MCF10A) и образцов первичных тканей (костного мозга мыши, мыши эмбриональной печени, мыши взрослых печени, опухоль мыши). Независимо от источник?…

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239