Provberedning för Mass Cytometry Analysis

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

Massa utnyttjar cytometry antikroppar konjugerade med tungmetall etiketter, ett tillvägagångssätt som kraftigt har ökat antalet parametrar och möjligheter för djup analys långt utöver vad som är möjligt med konventionell fluorescensbaserad flödescytometri. Som med all ny teknik, det finns kritiska steg som hjälper säkerställa tillförlitlig generering av data av hög kvalitet. Presenteras här är ett optimerat protokoll som innefattar flera tekniker för bearbetning av cellprover för mass cytometri-analys. De metoder som beskrivs här kommer att hjälpa användaren att undvika vanliga fallgropar och uppnå konsekventa resultat genom att minimera variationer, vilket kan leda till felaktiga uppgifter. Att informera experimentell design är logiken bakom valfria eller alternativa steg i protokollet och deras effektivitet i att upptäcka nya rön i biologi systemet utreds omfattas. Slutligen är representativ data som presenteras för att illustrera förväntade resultat från tekniker presented här.

Introduction

Cytometri möjliggör samtidig mätning av multipla antikropps mål på en enda cell nivå över stora populationer av celler. I traditionell fluorescensbaserad flödescytometri, är antalet parametrar som kan kvantifieras begränsas av spektral överlappning mellan emissionsspektrumet av multipla fluoroforer, som kräver alltmer komplexa beräkningar kompensations som antalet parametrar ökar. Dessa begränsningar adresseras av mass cytometri, där tungmetall-konjugerade antikroppar detekteras och kvantifieras genom flygtiden (TOF) masspektrometri för att kraftigt utöka antalet parametrar som samlats samtidigt och ge en hög dimensions protein-överflöd profil för varje individuell cell.

En grundläggande förståelse av arbetet i massan cytometry instrumentet är till nytta för användaren och kan vara avgörande för felsökning. För en mer ingående beskrivning av trimning och kör en massa cytometry maskin,se relaterade manuskriptet ^1. Kortfattat är ett cellprov märkt med en panel av metall konjugerade antikroppar riktade mot cellytemarkörer, cytoplasmiska proteiner, nukleära proteiner, kromatin-bundna proteiner eller andra epitoper av intresse (Figur 1 i). De märkta cellerna lastas på maskinen, antingen en i taget genom manuell injektion eller med användning av en automatisk provtagningsanordning som prov från en 96-brunnsplatta. De laddade cellerna injiceras genom en nebulisator, som alstrar en spray av vätskedroppar som inkapslar cellerna (Figur 1ii). Denna spray är positionerad så att cellerna är joniserade genom en argon plasmabrännare. Denna jonisering genererar en partikelmoln som består av alla de ingående atomerna i varje cell (Figur 1iii). Eftersom detta partikelmoln färdas till detektorn, är låga atommassenatomer separeras från de höga massjoner genom en kvadrupol massfilter. De återstående höga massjoner fortsätter till detektorn, där abundANCE av varje isotop kvantifieras (Figur 1iv). Rådata som samlas in av detektorn, analyseras med mjukvaru cytometri instrumentmassa för att identifiera cellhändelser. För varje identifierad cellhändelse, är den signal som detekteras i varje kanal kvantifierades och sparas till en utgång .fcs fil. Mass kanaler som används för detektering av tungmetall konjugerade antikroppar uppvisar minimal spektral överlappning, som sträcker sig från 0-4% med de flesta bidrag under 1%. På grund av denna låga överhörning mellan kanalerna, är det i allmänhet onödigt att omvandla data med en kompensationsmatris före analys ^2. Emellertid bör försiktighet iakttas under utformningen av den experimentella panel av antikroppar för att säkerställa att en antikropp med en hög-överflöd epitop inte är tilldelad till en masskanal som bidrar signal till en kanal tilldelad till en låg-överflöd antikropp, eftersom detta kan skapar en artificiellt hög befolknings i kanalmottagningssignalbidraget.

<p class = "jove_content"> Den exakta beredningen av prover för mass cytometrianalys är i hög grad beroende av de typer av prover samlas in och den experimentella hypotesen som testas. Tillhandahåller vi exempel på två protokoll för skörd av olika typer av celler (humana embryonala stamceller) och primära celler (mus brösttumörepitelceller isolat). När börjar en mass cytometry studie är det lämpligt att först genomföra en liten pilotexperiment för att säkerställa att alla protokoll och antikroppar som ska användas fungerar bra i utredarens händer. Detta är särskilt viktigt när anpassade konjugerade antikroppar som skall användas, eftersom den partiella reduktionsreaktion under antikroppskonjugering har potential att störa antikroppsaffinitet; därför måste varje anpassad antikropp som skall valideras empiriskt för att säkerställa uppgifternas noggrannhet. Andra överväganden innefattar bestämning av om cellyte antikroppar som skall användas i analysen kommer att känna igen deras epitoper efter fixering eller om de need som skall appliceras på levande celler. Viss fixering kan förhindra korrekt färgning med cellyte-antikroppar såsom är känt att inträffa med peptid-MHC-färgning ^{3, 4.} Utförande av cellytan antikroppsfärgning på levande celler kan vara nödvändigt för vissa antikroppar, men detta utesluter möjligheten att streckkodning före märkning antikropp såsom de flesta streckkodning metoder utförs efter fixering ⁵ även om antikroppsbaserad streckkodning ^{6, 7} är ett undantag.

Vid beräkningen av antalet av celler som skall förberedas för analys är det viktigt att veta att endast en bråkdel av cellerna lastas på maskinen kommer att detekteras och genererar data. Denna förlust beror främst på bristande effektivitet när nebulisatorn sprutar provet vid facklan. Den exakta procent förlust beror på massan cytometry maskininställning och celltyp, men kan sträcka sig från 50-85% och bör varabeaktas vid utformningen av experimentet. Detta protokoll har optimerats för 2×10 ⁶ celler per prov men kan anpassas för bearbetning av mindre eller större provstorlekar. Detta protokoll kan användas med minimala modifieringar för provstorlekar från 1 x 10 ⁶ till 4 x 10 ^6, men det är kritiskt att provstorleken hållas överensstämmande inom ett experiment. Förändringar i cellantal kan påverka intensiteten av streckkodning och antikroppsfärgning och bör hållas ungefär konsekvent mellan prover som skall jämföras direkt.

Vissa förfaranden, såsom döda celler märkning och DNA märkning ska utföras i de allra flesta, om inte alla experimentell design. Märkning av döda celler i experiment analysera endast ytmarkörer kan uppnås med användning Rh103, men Rh103 bör undvikas för experiment där permeabilisering krävs eftersom det resulterar i färgning förlust. För experiment som involverar permeabilization, är det lämpligt att använda cisplatin <supp class = "xref"> 8 och, om möjligt, till en antikropp som känner igen klyvd PARP eller klyvs kaspas upptäcka apoptotiska och döda celler.

Kodning prover kan minska bränsle antikropp, minskar anskaffningstiden och eliminera prov-till-prov variation ^9. Processen för streckkodning innebär att tillämpa en unik provspecifik kod till alla celler, som används för att tilldela varje cell till dess prov av ursprung. Efter streckkodning proverna kan poolas före antikroppsfärgning, en process som säkerställer alla prover är färgade lika. För att minimera experimentella felet, är det klokt att streckkoder och pool alla prover som ska direkt jämföras med varandra. För närvarande finns det flera metoder för streckkodning prover för mass cytometrianalys ^{5, 6, 7,} varav två presenteras här (se nedan).

Med för närvarande tillgänglig reagents är det möjligt att kvantifiera överflödet av 38 mål antikropps, identifiera celler i S-fas ^10, särskilja levande och döda celler ⁸ och mäta cellulära nivåer av hypoxi ¹¹ i ett multiplexerat experiment av multipla prover. Denna förmåga att samla hög parameter enda celldata för stora cellpopulationer möjliggör förbättrad profilering av mycket heterogena cellpopulationer och har redan producerat ett antal nya biologiska insikter ^{12, 13, 14, 15, 16.} Destillation av den resulterande komplexa data till tolkningsbar information har krävt användning av beräkningsalgoritmer inklusive Spänning Tree Progression av Density Normaliserade evenemang (SPADE) ¹⁷ och viSNE ^18.

I denna artikel presenteras en tillgängligöversikt över hur du utforma och genomföra en massa cytometry experiment och introducerar grundläggande analys av massa cytometry data.

Protocol

1. Cellskörd Skördar celler från primär vävnad OBS: Det beskrivna förfarandet för skörd av celler från primär vävnad är specifikt tillämpliga på mus brösttumörvävnad och kan inte tillämpas som det är till primära vävnader från andra källor. Förbereda digereringsbuffert genom att lösa upp 5 mg hyaluronidas och 30 mg kollagenas i 10 ml DMEM / F12-media per gram vävnad som skall behandlas. Filtrera sterilisera digestionsbuffert. Isolera primär…

Representative Results

Det protokoll som presenteras här kan tillämpas i stora drag till en bred variation av odlade och primära cellprover med endast mindre modifieringar. Beroende på kraven av försöket, kan den utföras på ett modulärt sätt när vissa element, såsom streckkodning eller cellytan färgning, inte är nödvändiga. Utnyttjas i sin helhet detta protokoll möjliggör framställning av multiplexerade massa cytometri prover märkta för död cell utslagning, S-fas populationen identifierin…

Discussion

Det protokoll som presenteras här har med framgång använts för behandling av olika odlade cellinjer (H1 och H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) och primära vävnadsprover (musbenmärg, mus embryonala levern, mus vuxna lever, mustumör). Oberoende av källan, vilken vävnad som helst som kan dissocieras till enstaka celler och samtidigt bevara den cellulära tillstånd bör vara tillgängliga för analys av mass cytometri, men kan kräva viss protokolloptimering. Det är viktigt att notera att vissa …

Materials

mTeSR1 medium kit	Stem Cell technologies	05850	Warm at room temperature before use
DMEM F-12	ThermoFisher	11330-032	Warm at 37°C before use
Accutase	Stem Cell technologies	07920	Warm at 37°C before use
Bovine serum albumin	Equitech	BAH62
phosphate buffered saline	Hyclone	SH30256.01
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Cell ID Pt194	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt195	Fluidigm		Provided at 1mM
Cell ID Pt196	Fluidigm		Provided at 1mM
Cisplatin	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit	Fluidigm	201060
5-Iodo-2'-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	I7125	Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agent	Fluidigm	201103A
Methanol	Fisher	BP1105-4	Chill at -20°C before use
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002
5ml round bottom tubes	Falcon	352058
5ml 35um filter cap tubes	Falcon	352235
EQ four element calibration beads	Fluidigm	201078
Hyaluronidase Type I-S	Sigma-Aldrich	H3506
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9891
Disposable Scalpel #10	Sigma-Aldrich	Z69239