Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
Kütle sitometrisi ağır metal etiketler, iyi sitometrisi geleneksel floresan bazlı akışıyla mümkün olanın ötesine parametreleri ve derin analiz için imkânlar artırılmıştır ölçüde olan bir yaklaşımla konjuge antikorları kullanır. Herhangi bir yeni teknoloji olduğu gibi, yüksek kaliteli veri güvenilir nesil sağlamaya yardımcı kritik adımlar vardır. kütle sitometri analizi için hücre örneklerinin işleme için birden çok teknikler içerir optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur. Burada anlatılan yöntemleri kullanıcı ortak tuzaklardan kaçınmak ve yanlış verilere yol açabilir değişkenliği, minimize ederek tutarlı sonuçlar elde yardımcı olacaktır. Deneysel tasarım bilgilendirmek için, protokol ve araştırılmaktadır sisteminin biyolojide yeni bulgular ortaya çıkarmada bu etkinliği açısından isteğe bağlı veya alternatif aşamalar arkasındaki mantık kaplıdır. Son olarak, temsilci veri teknikleri présente beklenen sonuçları göstermek için sunulmuşturBurada d.
Introduction
Sitometri büyük hücre popülasyonları arasında, bir tek hücre düzeyinde birden, antikor hedefi ölçümünü sağlar. Geleneksel flüoresan bazlı akış sitometrisi olarak, ölçülebilir parametre sayısı parametreleri sayısı arttıkça daha karmaşık dengeleme hesaplamalar gerektirir birden florofor emisyon spektrumu arasındaki spektrum çakışmasının ile sınırlıdır. Bu kısıtlamalar, ağır metal-konjüge edilmiş antikorları tespit edilir ve büyük ölçüde eş zamanlı olarak toplanır parametre sayısını arttırmak ve her bir hücre için yüksek bir boyutsal protein bolluğu profilini elde etmek için bir uçuş (TOF) kütle spektrometresi zaman ile hesaplanır kütle sitometrisi tarafından ele alınmaktadır.
enstrümanın sitometrisi kütlenin çalışmaları bir temel anlayış kullanıcıya faydalıdır ve sorun giderme için gerekli olabilir. Daha kapsamlı bir ayar açıklaması ve kitlesel sitometrisi makinesini çalıştıran için,ilgili el yazması 1 'e bakınız. Kısaca, bir hücre numunesi, hücre yüzeyi markerleri sitoplazmik proteinleri, nükleer proteinler, kromatin bağlı proteinleri veya (Şekil 1i) 'in diğer epitopları hedefleyen metal konjuge bir antikor paneli ile etiketlenir. Sınıflandırılmış hücreler, bir otomatik numune alıcı ile makineye yüklenmiş, ya el ile enjeksiyon sureti ile bir zamanda bir ya da olduğu, 96 oyuklu bir plaka örnekler. Yüklü hücreler hücreler (Şekil 1ii) kapsül, sıvı damlacıkları spreyini üreten bir nebulizer aracılığıyla enjekte edilir. Hücreler, bir argon plazma lambasının iyonize böylece Bu sprey konumlandırılır. Bu iyonizasyon her bir hücre (Şekil 1iii) oluşturan bütün atomlardan müteşekkil bir partikül bulutu oluşturur. Bu partikül bulutu detektöre ettikçe, düşük atomik kütle atomu, bir dört kutuplu kütle filtre ile yüksek kütle iyonu ayrılır. Geri kalan, yüksek kütle iyonlarını dedektörü, abund devamHer bir izotopun formans (Şekil 1iv) ölçülür. detektör tarafından toplanan ham veriler, hücre olayları tanımlamak için kitle sitometrisi enstrüman yazılımı tarafından analiz edilir. Tanımlanan her bir hücre etkinliği için, her bir kanal tespit sinyali ölçülür ve bir çıkış .fcs dosyaya kaydedilir. ağır metal olarak birleştirilmiş antikorlarını tespit etmek için kullanılan seri kanal% 1'in altında en katılım% 0-4 arasında değişmektedir az spektral örtüşme sergiler. Çünkü kanallar arasında bu düşük çapraz konuşma, analiz 2 önce bir telafi matris veri dönüştürmek için genel olarak gereksizdir. Ancak, bakım, bu gibi, bir yüksek bolluk epitopa sahip bir antikor, bir düşük miktardaki bir antikor atanmış bir kanala sinyali katkıda bulunan bir kütle kanalına tahsis emin olmak için antikorların deneysel panelinin tasarımı sırasında alınmalıdır sinyal katkı alıcı kanalın bir yapay yüksek nüfus oluşturmak.
<p cleşek = "jove_content"> sitometri analizi kütle için numune kesin hazırlanması toplanan numunelerin tiplerine bağlıdır ve deney hipotezi test edilir. Bu farklı hücre tiplerini (insan embriyonik kök hücreler) ve birincil hücreler (fare meme tümörü epitel hücre izolatı) hasat etmek üzere iki protokol örneklerini temin etmektedir. Bir kitle sitometrisi Çalışmanın başlangıcında, her şeyden önce protokolleri ve antikorlar araştırmacının elinde iyi çalışıyoruz yararlanılacak sağlamak için küçük bir pilot deneyi yürütmek için tavsiye edilir. Özel konjüge antikorlar kullanılacak olan bu antikor, konjugasyon sırasında kısmi indirgeme reaksiyonu gibi antikor afinitesini bozmaya potansiyeline sahip, özellikle önemlidir; Bu nedenle, her bir özel antikorun veri doğruluğunu sağlamak için deneysel olarak doğrulanmış edilmesi gerekmektedir. bunlar ne ise hücre yüzeyi antikorları tespit sonrası epitoplarını tanıyacak tahlilinde kullanılabilir veya eğer diğer hususlar anlaşılması,ed hücrelerini canlı uygulanacak. Peptit-MHC 3, 4 boyanması ile oluştuğu bilinmektedir gibi bazı sabitleme hücre yüzeyi antikorlarıyla uygun boyama engelleyebilir. Canlı hücreler üzerinde hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirilmesi bazı antikorlar için gerekli olabilir, ama bu antikor bazlı barkod 6, 7, bir durum olduğu halde en çok barkod yöntemleri tespit 5 sonra gerçekleştirilir gibi antikor etiketleme önce barkod seçeneğine engeller olabilir.hücre sayısının belirlenmesi analizi için hazırlanacak olduğunda, makine üzerine yüklenen hücrelerin sadece bir kısmı tespit edilecek biliyoruz ve veri üretmek için önemlidir. nebülizör torçta örnek spreyler, bu kayıp verimsizliklere esas kaynaklanmaktadır. Kesin yüzde kaybı% 50-85 arasında olabilir makine kurulumu ve hücre tipi ama sitometrisi kütlesine bağlıdır ve olmalıdeney tasarımı düşündü. Bu protokol, numune başına 2×10 6 hücreleri için optimize edilmiş ama daha küçük ya da daha büyük örneklerin işlenmesi için uyarlanabilir. Bu protokol, ancak örnek sayısı, bir deney içinde tutarlı tutulması önemlidir, 4 x 10 6, 1 x 10 6 örnek boyutları için, en az modifikasyon ile kullanılabilir. Hücre sayısındaki değişimler barkod ve antikor boyama yoğunluğunu etkileyebilir ve numuneler doğrudan karşılaştırılmalarını mümkün boyunca yaklaşık tutarlı tutulmalıdır.
tüm deneysel tasarımlar değilse böyle ölü hücre etiketleme ve DNA etiketleme gibi bazı uygulamalar ise, büyük çoğunluğunda yapılmalıdır. Sadece yüzey belirteçleri analiz eden deney ölü hücrelerin etiketlenmesi Rh103 kullanılarak elde edilebilir, ancak Rh103 bu boyama kaybına yol açtığı için geçirimli hale gereklidir deneyler için kaçınılmalıdır. geçirgenliği içeren deneyler için, sisplatin kullanılması tavsiye edilir <sSınıf = "xref"> 8 ve yukarı mümkün olduğunda, yarık PARP ve klivaj Kaspaz tanıyan bir antikor apoptotik ve ölü hücrelerin tespit etmek.
Çizgi örnekler, antikor tüketimini azaltmak etme süresini azaltmak ve ortadan kaldırabilen örnek-örnek değişkenlik 9. barkod süreci menşe örnek için her hücre atamak için kullanılan tüm hücreler, benzersiz bir numuneye özgü kod uygulanmasını içerir. örnekleri barkod sonra antikor boyaması, tüm örnekler eşit boyanmış sağlayan bir yönteme önce toplanmış olabilir. Deneysel hatayı en aza indirmek için, barkodun ihtiyatlı ve doğrudan birbirlerine karşılaştırılacak hiçbir örnekleri havuz. Şu anda (aşağıya bakınız) burada sunulmaktadır ikisi analizi 5, 6, 7, sitometrisi kitle için örnek barkod için çeşitli yöntemler de mevcuttur.
şu anda mevcut Reagen ile38, antikor hedefi bolluğu ölçmek S-fazı 10 hücreleri tespit canlı ve ölü hücreler 8 ayırt ve çok sayıda numune bir çoğullamalı deneyde hipoksi 11 hücresel seviyelerinin ölçülmesi mümkündür ts. Büyük hücre popülasyonları için yüksek bir parametre, tek bir hücre veri toplamak için bu yeteneği yüksek ölçüde heterojen bir hücre popülasyonlarının iyileştirilmiş profil sağlar ve daha önce, yeni biyolojik anlayış, 12, 13, 14, 15, 16, bir dizi üretti. Yorumlanabilir bilgilere elde edilen kompleks veri Damıtma Kapsayan Ağaç Yoğunluk Normalize Olayların Gelişimi (maça) 17 ve vişne 18 de dahil olmak üzere bilgisayar algoritmaları kullanımını gerektirmiştir.
Bu makale erişilebilir bir sunarnasıl genel tasarım ve deney sitometri bir kitle yürütmek ve veri sitometrisi kitlenin temel analizini tanıtır için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol başarıyla çeşitli kültürlenmiş hücre çizgileri (H1 ve H9 HESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) ve birincil doku örnekleri (fare kemik iliği, fare embriyonik karaciğer, fare yetişkin işlenmesi için kullanılan edilmiştir karaciğer, fare tümör). Bağımsız kaynağı, hücre durumunu muhafaza sitometrisi kütle analizi için uygun olmalıdır, ancak bir protokol optimizasyon gerektirebilir ise tek hücre halinde ayrılabilir bir doku. Bazı epitoplar kullanılan spesifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
References
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
